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清开灵注射液对流感病毒感染的信号传导通路的实验研究

王甫

   甲型流感病毒(influenza A virus)是一种引起最为常见和高传染性人类疾病的因素,该病毒分布于世界各地,在人类和动物中具高致病率和死亡率。尽管对流感病毒进行了广泛的临床和病理学研究,但我们对于流感的发病机制仍不完全明了。 哺乳动物先天性免疫系统通过一类属于Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)家族的受体识别入侵病原体。病毒感染可触发一系列免疫反应能有效限制病毒复制和病毒感染的传播。目前研究发现病毒感染的细胞后通过影响NF-KB信号通路发挥先天抗病毒免疫反应,导致共刺激分子的活化和细胞因子的产生,并引发随后的特异性免疫应答;如果该通路活化失控,则会导致大量前炎症介质产生,导致机体的炎症损伤。中医学认为流感的病机主要是“毒损肺络”,为感染性肺损伤,是流感病毒的致炎与机体的抗炎反应过程。在本实验研究中,将选用清开灵注射液对流感病毒感染细胞后功能调节作用机制进行深入研究,尤其是从基因和蛋白分子水平上探讨清开灵注射液抗流感病毒的作用机制,为清开灵注射液的临床应用提供理论依据,而且具有重要的经济意义和社会效应。 目的: 研究流感病毒感染细胞后,清开灵注射液体外不同加药剂量对流感病毒在感染细胞后NF-KB信号传导通路的下调作用。通过测定流感病毒感染细胞释放相关细胞因子水平的动态变化,主要检测细胞中mRNA水平TNF-α的变化,阐述清开灵注射液通过下调病毒感染细胞后NF-KB信号传导通路的活化,抑制炎性细胞因子TNF-α的过量产生,减轻炎症反应的作用机制,为临床应用提供实验依据。 方法: 1通过双荧光素酶报告实验确定清开灵注射液对对流感病毒感染细胞后NF-K B信号传导通路的下调作用:提取双荧光酶报告实验所需的质粒,NF-kB-luc,pRL-TK,GFP,转染细胞后检测每孔的转染效率,测定relativeluciferase的相对值。探讨清开灵注射液对病毒感染细胞后NF-K B信号传导通路的影响。 2清开灵注射液对流感病毒感染细胞后分泌细胞因子TNF-αmRNA水平的影响:采用RT-PCR方法研究清开灵注射液不同剂量对流感病毒感染的293T细胞,通过NF-kB信号转导通路发挥抗病毒作用的具体分子机制。用RT-PCR方法观察TNF-αmRNA表达水平的变化。 结果: 1从双荧光素酶报告实验中的relative luciferase assay可以看出,清开灵注射液能明显抑制NF-KB信号传导通路,并且呈剂量依赖性(2~(-9)、2~(-8)、2~(-7)、2~(-6)倍稀释)。 2 RT-PCR结果表明,清开灵注射液能从mRNA水平降低TNF-α的表达,并且也呈现一定的剂量依赖性。 结论: 1清开灵注射液可剂量依赖性的抑制炎症因子TNF-α的产生,该作用是可以从mRNA水平可以得到证实。该药显著下调TNF-α水平,减轻炎性病理损伤;调节机体免疫功能,从而提高机体抗病毒作用,增强抗病毒能力而减轻病毒对机体的损伤作用,控制病情发展 2清开灵注射液可剂量依赖性的抑制炎症因子是通过抑制NF-κB信号转导通路实现的。该药能显著下调病毒感染细胞内NF-κB表达水平,为研究中药抗病毒作用开拓了一条新的探索途径。……   
[关键词]:清开灵;293T细胞;抗病毒;流感病毒;NF-ΚB;TNF-α;信号转导
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:北京中医药大学2009年