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锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制动力学研究

林建成

   以锯缘青蟹(Scytta Serrata)内脏为材料,通过含0.2 mol/LNaCl的0.01 mol/LTris-HCl(pH 7.5)缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱过滤层析、DE-32离子交换柱层析,分离提纯NAGase(NAGase),获得比活力为7,990U/mg的电泳单一纯NAGase制剂(NAGase,EC 3.2.1.52)。本文以此酶制剂为对象展开以下几方面的研究。 研究过氧化氢对锯缘青蟹NAGase活力的影响及抑制动力学。其结果表明,过氧化氢对该酶有显著的抑制作用,随着过氧化氢浓度的增高,酶活力呈指数下降,测出可使酶活力下降50%的过氧化氢浓度(抑制半衰期,IC_(50))为0.115 mol/L。低浓度过氧化氢对该酶的抑制过程显示为可逆效应。采用底物反应动力学方法研究过氧化氢对该酶的抑制作用动力学、建立动力学模型,测定游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)的微观抑制速度常数k_(+0)和K′_(+0)并加以比较。实验结果(k_(+0)>k′_(+0))表明底物对酶被过氧化氢的抑制作用有一定的保护作用。过氧化氢可能是通过氧化酶活性中心功能基团而导致酶活性的丧失。该研究对了解NAGase的功能基团性质及酶的催化作用机理提供重要的实验基础。 研究脲对酶的效应,结果表明,脲对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)有失活作用,随着脲浓度的增大,酶活力呈指数下降,测定导致酶活力下降50%的脲浓度(失活半衰期,IC_(50))为0.63 mol/L。酶在脲溶液中的失活过程显示为可逆失活。用底物反应动力学方法考察酶在脲溶液中的失活动力学,测定游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)在脲溶液中失活的微观速度常数,并比较游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)的正向反应的微观失活速度常数,表明底物存在对酶被脲的失活作用有一定的保护作用。正向的失活速度常数k_(+0)和k′_(+0)随着脲浓度的增大而增大,而逆向的速度常数k_(-0)随着脲浓度的增大而减小。表明随着脲浓度的增大,酶变性越来越快,而活力恢复越来越难。 研究十六种氨基酸对酶的效应,结果表明:非极性氨基酸中Gly、Ala、leu、Phe对酶活力几乎没有作用,Val、Ile对酶略有激活,Val浓度为20 mmol/L使酶活力提高7.5%,Ile浓度为40 mmol/L,使酶活力提高10.5%。Pro,Met对酶活力略有抑制作用,当Pro浓度为40 mmol/L时分别使酶活力下降15.2%,当Met浓度为40 mmol/L时分别使酶活力下降9.8%.极性氨基酸Asn、Cys、Ser、Thr对酶的活力没有影响。带负电荷的酸性氨基酸Asp和Glu对酶有抑制作用,当Asp浓度为40 mmol/L时,使酶活力下降38%;当Glu浓度为40 mmol/L时,可使酶活力下降25%。带正电荷的碱性氨基酸His略有抑制,Lys和Arg抑制作用较强,研究Lys和Arg对酶催化pNP-NAG水解反应的抑制机理,并测定其抑制常数,结果表明Lys和Arg的对酶的抑制均表现为可逆效应,抑制类型均为反竞争性抑制,其Kis分别为5.29 mmol/L和3.76 mmol/L。 研究对-氯汞苯甲酸(pCMB)对NAGase的化学修饰作用,巯基是酶活性的必须基团。氯化汞对锯缘青蟹NAGase抑制动力学研究,结果证明:当汞离子浓度小于1.0 lamol/L时,汞离子对剩余酶活力的作用表现为可逆反应,汞离子对酶的抑制机理属于竟争性抑制类型。通过汞离子对酶抑制作用的动力学模型的建立,测定游离酶(E)和酶.底物络合物(ES)在氯化汞溶液中失活的微观速度常数,研究汞离子浓度与表观速度常数之间的关系,结果证明:仅一分子氯化汞结合到酶分子活性中心就可导致酶活性的丧失。实验结果提示半胱氨酸残基位于酶活性中心,是酶分子的必须基团。……   
[关键词]:锯缘青蟹;N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶;效应物;抑制作用
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:厦门大学2008年