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兔支气管败血波氏杆菌检测方法的建立及应用

王欣

   支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是一种重要的病原菌,广泛感染包括猪、犬等家畜,兔、豚鼠等实验动物,雪貂、考拉熊及栗鼠等野生动物在内的多种哺乳动物,并造成急慢性的呼吸道疾病。人也有感染该菌的报道,尤其是小孩和免疫力缺陷的人群。近年来,随着我国规模化养兔业的发展,支气管败血波氏杆菌感染明显增加,并常与多杀性巴氏杆菌、葡萄球菌等混合感染,已成为兔业养殖中发病率和死亡率增加的重要原因之一,给养兔业造成重大的经济损失。 本研究由三部分组成,一是OMP-ELISA抗体检测方法的建立及应用;二是针对支气管败血波氏杆菌的菌毛蛋白建立并比较了三种抗体检测方法;三是PCR检测方法的建立及应用。主要试验和结果如下: 1.应用超声波裂解结合超速离心法提取支气管败血波氏杆菌外膜蛋白(OMP),包被酶标板,建立了检测兔波氏杆菌病抗体的间接ELISA方法。试验确定抗原的包被浓度为14.44μg/mL,检测血清作1:400稀释,以及间接ELISA的最佳反应条件。该方法有很高的特异性和重复性,与微量凝集试验相比,符合率为87.56%,敏感性提高约33倍。该ELISA方法不仅敏感、特异、快速、简便,而且经济、易于重复,适于推广应用。 2.利用超声波处理结合TritonⅩ-100溶解法制备粗提的菌毛抗原,建立了三种用于支气管败血波氏杆菌的抗体检测方法:琼脂免疫扩散试验(AGE))、玻片凝集试验(SAT)、间接血凝试验(IHA)。临床检测了458份兔血清样品,结果发现,IHA试验的阳性检出率最高(73.36%),其次为AGID(63.54%)和SAT试验(61.79%);IHA与AGID的符合率为90.17%,与SAT试验的符合率为86.68%,AGID与SAT的符合率为89.08%。IHA更为敏感,且与AGID有较好的符合率,可用于支气管败血波氏杆菌的血清学监测。 3.根据GenBank中支气管败血波氏杆菌菌毛蛋白基因(fim2)序列设计了一对引物,扩增出大小为425bp的目的基因片段,建立了快速检测兔支气管败血波氏杆菌的PCR方法。该产物序列与GeneBank上公布的基因序列同源性为100%。特异性和敏感性试验表明,该方法对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌均无交叉性反应,并且最小可检出菌液浓度为3.6CFU。用该PCR方法检测了从江苏、山东等地采集的146份兔鼻拭子,结果检出支气管败血波氏杆菌阳性92例,阳性率为63.01%。 本试验应用超声波裂解结合超速离心法制备了Bb的外膜蛋白,建立了间接ELISA抗体检测方法,为进一步研制出支气管败血波氏杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒提供了参考;利用超声波处理结合TritonⅩ-100溶解法制备粗提的菌毛抗原,建立了三种用于支气管败血波氏杆菌的抗体检测方法:琼脂免疫扩散试验(AGID)、玻片凝集试验(SAT)、间接血凝试验(IHA),为基层部门临床检测和流行病学调查提供了依据;根据Bb主要毒力因子fim2基因建立了快速检测兔支气管败血波氏杆菌的PCR方法。……   
[关键词]:;支气管败血波氏杆菌;ELISA;AGID;IHA;SAT;PCR;检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2008年