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拟无枝酸菌转化洛伐他汀为无锡他汀的发酵优化及无锡他汀的初步提取

王方

   他汀类药物属于羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,为降脂药物中的首选药物,也是国内外研究的热点之一。无锡他汀(本实验室拥有自主知识产权)是一种新型HMG-CoA还原酶抑制剂,由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)转化产生。本论文主要对Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀的发酵条件进行了研究,并对转化产物无锡他汀分离提取进行初步探索。 首先,在摇瓶水平上研究发酵条件对Amycolatopsis sp.ST2710菌体形态、洛伐他汀转化率的影响。通过对培养基初始pH值、装液量、接种方式、接种量和摇床转速等因素对菌体形态影响的考察。结果表明,当菌丝球大小较均匀,菌球为直径0.5~0.7 mm时有利于洛伐他汀的转化。故剪切力的大小是影响洛伐他汀的转化效率的关键因素。同时,考察了洛伐他汀溶液对Amycolatopsis sp.ST2710生长的影响,洛伐他汀临界抑制浓度为1.5 g/L,洛伐他汀添加浓度以1.0 g/L为宜;洛伐他汀转化的适宜温度为28℃,与菌体生长期的最适温度一致;经发酵条件优化后,最佳发酵条件为:培养基初始pH 7.0~8.0、装液量25 mL/250 mL三角瓶、接种方式为孢子接种、接种量10%、摇床转速为120 r/min,无锡他汀的产量可达0.48 g/L。 根据摇瓶水平分批发酵最优条件,对菌株Amycolatopsis sp.ST2710进行5 L发酵罐分批发酵试验。分别考察搅拌转速对溶氧、菌体量、菌体形态和洛伐他汀转化的影响。结果表明,转速为300 r/min时能提供充足的氧气使细胞快速生长;而较低的转速(200 r/min)能在转化阶段减少泡沫的产生,有利于洛伐他汀的转化。基于不同搅拌转速下的洛伐他汀转化率的变化情况,提出了分阶段搅拌转速控制策略:第一阶段,菌体生长期搅拌转速300 r/min;第二阶段,洛伐他汀转化期搅拌转速200 r/min。经实验验证,采用搅拌转速控制策略,菌体生长末期,菌体量达4.02 g/L,至转化结束时,无锡他汀产量达0.50 g/L,发酵周期为80 h,比摇瓶发酵缩短了16 h。为有效减缓底物洛伐他汀的抑制,进行了5 L罐补料分批发酵研究。对洛伐他汀采用补料分批发酵,产物产量达1.21 g/L,与未补料发酵相比产量提高1.4倍。 此外,从5种树脂中筛选出HP20树脂,对发酵液中无锡他汀进行分离提取,考察了HP20树脂的吸附、解吸效果及影响因素。静态实验表明,非极性树脂HP20对无锡他汀的吸附容量为89.89 mg(无锡他汀)/g(干树脂),最佳吸附pH为7.0左右,适宜吸附时间为3 h左右,洗脱剂为丙酮水溶液,洗脱率达95.3%。动态实验确定吸附流速为1.0 BV/h时,每毫升湿树脂对发酵液中无锡他汀的吸附量为60 mg,较佳的上样浓度为0.9~1.1 g/L,用丙酮水溶液进行分阶段梯度洗脱,含无锡他汀的洗脱液为无色,无锡他汀回收率和浓度分别达75%和95%。……   
[关键词]:洛伐他汀;无锡他汀;拟无枝酸菌;微生物转化;发酵条件优化;大孔吸附树脂;分离提取
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2008年
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