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砂梨果实成熟相关基因的克隆及其RNAi载体的构建

胡钟东

   砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)原产于我国中部、南部和西部各省,适于在温暖多雨地区栽培,是原产于中国的四个梨栽培种之一,具有耐热、抗旱、抗火疫病等优良性状。但其果实大多贮藏性差。如何提高果实耐贮性是解决好砂梨产业化的关键问题。目前的研究主要是针对砂梨果实的生理特点,通过改善果实的贮藏条件和采用一些乙烯抑制剂来延长砂梨果实的货架期,不能解决根本问题。我们以‘若光 梨为材料,研究适于‘若光 梨叶片离体再生的培养基的种类以及激素配比,克隆‘若光 果实中与成熟相关的基因并构建其RNA干扰载体,将构建的载体分别进行农杆菌介导的梨、番茄、烟草转化,研究干扰基因在植物体内的表达特性,为将来获得耐贮砂梨新种质提供了基础。 1、为了获得‘若光 梨高效的叶片离体再生体系,和为‘若光 梨的耐贮基因工程研究提供条件,以‘若光 梨叶片为材料,研究了不同激素的种类与浓度组合对砂梨叶片离体再生的影响。结果发现,以NN_(69)为基本培养基,附加TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.15 mg/L+AgNO_3 0.1 mg/L处理‘若光 梨叶片,暗培养21d后,再置于光照条件下培养30d,‘若光 梨叶片不定芽再生频率达到了63.2%。 2、根据已登录的砂梨ACO3(GenBank Accession No.AB042107)序列设计并合成一对特异引物,以‘若光 梨叶片总DNA为模板,利用染色体步移技术扩增基因的上游调控序列。回收该片段并克隆到pMD19-T载体上,测序后去除接头和基因编码序列,得到一段长715bp的上游序列。登陆PLACE数据库在线进行植物DNA顺式作用元件预测与分析,起始位点的上游89bp处有一个TATA-Box核心启动子元件。另外,序列还存在多个特异调控基因表达的元件。初步判断其为砂梨果实中ACC氧化酶基因的诱导型启动子。 3、以‘若光 梨成熟果实为材料,提取总RNA。在ACC氧化酶基因(ACO)mRNA序列同源性较高区域,用Primer premier5软件设计一对特异引物,利用RT-PCR克隆得到了401bp长的片段。经过测序和核苷酸、氨基酸比对,发现与登录的ACC氧化酶基因(ACO3)同源性达到99%。据此判断,得到的片段为砂梨的ACC氧化酶基因序列。根据序列设计两对分别加了不同酶切位点的正、反基因的特异上下游引物,扩增出ACO的正、反义基因。将ACO反义基因、与副球菌中类胡萝卜素合成有关的间隔基因YYT(GenBank with accession number AY345165)以及ACO正义基因三个片段串联在一起,并克隆到T载体。经测序鉴定正确后,双酶酶切下目标片断并插入到植物表达载体中,构建成能够表达ACC氧化酶基因的双链RNA的植物载体pYF028。 4、为了研究ACO干扰基因在植物体中的表达特性,通过农杆菌介导法转化番茄子叶,将侵染的520个外植体先经MS+ZT 1mg/L+IAA 0.5 mg/L+Km 50 mg/L+250 mg/LCef+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH 5.8)筛选培养基,初步筛选出Km抗性芽。将筛选出的抗性芽再经过2次继代培养,共得到34个抗性株系。将抗性株系转到生根培养基MS+IAA 0.5 mg/L+Km 50 mg/L+Cef250mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7g/L(pH5.8)中生根,经过30d的生根培养,共得到了6个生根株系。经过GUS染色、PCR、RT-PCR检测验证。初步证实,干扰基因已经整合到番茄的基因组中。进一步进行其乙烯发生量的检测,结果发现,转干扰基因番茄植株的乙烯释放量显著高于对照。 5、以‘若光 梨成熟果实为材料,提取总RNA并反转录成cDNA。根据脂氧合酶氨基酸保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR克隆到1段长827bp的cDNA序列。经Blast比对和DNAstar软件聚类分析,结果表明,由该序列推导出的氨基酸序列含有脂氧合酶氨基酸保守结构域,与马铃薯脂氧合酶基因的氨基酸序列相似性达到77.5%。判断为砂梨脂氧合酶基因片段,命名为LOX1,并将序列登录到GenBank,登录号为EF215448。根据RNAi载体的构建原则,选择LOX1中一开放阅读框设计携带酶切位点的特异引物,通过PCR扩增LOX1正、反向基因片段,再与YYT间隔区串连,插入植物表达载体pYF7713中的相应位置。构建了干扰砂梨LOX基因表达的RNAi植物双元表达载体pYL028。 6、为了研究干扰基因在植物体中的表达特性,我们将构建好的‘若光 梨LOX1干扰表达载体(pYL028),通过农杆菌介导法转化烟草叶片;将侵染的113个外植体先经MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+Km 50 mg/L+Cb 250 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH 5.8)的筛选培养基培养,初步筛选出Km抗性芽。抗性芽再经2次继代培养,共得到16个抗性株系。将抗性株系转到1/2MS+IBA 0.1 mg/L+Cb 250 mg/L+Km 50 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH 5.8)的生根培养基中生根,经过30d的生根培养,共得到了5个生根株系。经过GUS染色、PCR、RT-PCR检测验证,初步证实,干扰基因已经整合到烟草的基因组中。进一步检测脂氧合酶及相关酶的活性,结果显示,在低温胁迫条件下,转基因植株与未转基因的对照植株相比,LOX酶的活性被抑制37.8%;SOD、CAT和POD酶活性显著升高。MDA的含量显著降低。 7、根据脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)氨基酸保守区设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从‘若光 梨成熟果实中克隆到一段eDNA特异片段,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑单克隆测序,得到了两段长度均为827bp,编码275个氨基酸残基的核苷酸序列,经BLAST分析,由序列推导的氨基酸序列含脂氧合酶基因氨基酸保守结构域,据此推断得到的片段为砂梨脂氧合酶基因家族中的2个新成员,分别命名为LOX2、LOX3,并登录GenBank(EF215449,EF215450)。经DNAStar软件分析,结果显示砂梨果实中表达的LOX2基因可能与果实种子发育有关,而LOX1和LOX3基因为砂梨果实胁迫条件下诱导表达的基因。……   
[关键词]:砂梨;不定芽再生;ACC氧化酶;调控序列;克隆;脂氧合酶;ACO干扰基因;LOX干扰基因;农杆菌介导;番茄;烟草
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2007年