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重组人血管内皮抑素治疗鼠源性血管瘤的实验研究

张翅

   第一部分重组人血管内皮抑素对鼠血管瘤内皮细胞株EOMA增殖的影响 目的:研究重组人血管内皮抑素(Recombinant human endostatin, YH-16, Endostar )对鼠源性血管内皮瘤细胞株( Mouse hemangioendothelioma cell line,EOMA)的抑制作用及其机制,并与血管瘤常用药物曲安缩松(Triamcinolone Acetonide)、平阳霉素(Pingyangmycin,PYM)、干扰素α-2a(Interferon alfa-2a,INFα-2a)相比较,观察单用及联合用药对EOMA细胞的抑制作用。 方法:①MTT法检测不同浓度的YH-16、PYM、曲安缩松及INFα-2a单用对EOMA细胞作用24h、48h、72h的抑制率,筛选出四种药的最适抑制浓度。②MTT法比较YH-16、PYM、曲安缩松、INFα-2a四种药物单用对EOMA细胞增殖抑制作用的强弱。③MTT法检测YH-16、PYM、曲安缩松三药两两联合应用对EOMA细胞的抑制作用(金氏公式法判断联合用药的效果)。④采取流式细胞术测定YH-16作用EOMA细胞48h后,细胞凋亡率及Caspase-3表达的变化。 结果:①YH-16各浓度组在24h、48h及72h三个作用时间点对EOMA细胞抑制作用显著(P<0.01),并存在明显的剂量依赖关系。②YH-16 200μg/mL组在各时间点,其抑制率(Inhibitory rate,IR)均高于50μg/mL、100μg/mL组(P<0.05),而与400μg/mL及800μg/mL组比较差异无统计学意义(P>0.05),故筛选出200μg/mL为最适抑制浓度;同样方法筛选出PYM、曲安缩松、INFα-2a的最适抑制浓度分别为150μg/mL、250μg/mL、5×105u/mL。③四种药物抑制作用由强到弱:PYM>YH-16>曲安缩松>INFα-2a。④各浓度的YH-16与曲安缩松或与PYM联合作用EOMA细胞时,其联合效应均为拮抗效应,Q值均<0.85;各浓度的PYM与曲安缩松联合作用EOMA细胞,其联合效应为相加效应,0.85<Q值<1.15。⑤YH-16作用后细胞凋亡率随药物浓度增加而增高,Caspase-3表达在YH-16各浓度组均增强(P<0.01)。 结论:①YH-16对EOMA细胞有确切的抑制作用。该作用弱于PYM,而强于曲安缩松及INFα-2a。②这种抑制作用主要是通过诱导细胞凋亡实现,且Caspase-3参与此过程。③YH-16能拮抗曲安缩松及PYM抑制EOMA细胞增殖的作用;曲安缩松能增加PYM对EOMA的抑制增殖作用。 第二部分Kasabach-Merritt综合征裸鼠模型的建立 目的:建立Kasabach-Merritt综合征裸鼠移植模型。观察肿瘤生长情况,了解其生物学特点。 方法:①收集对数生长期的EOMA细胞,调整成1×107/mL活细胞浓度,将100uL细胞悬液接种于裸鼠右侧腰背部皮下。对照组在同样部位皮下注射等量PBS。②隔日观察肿瘤的生长情况,用游标卡尺记录肿瘤的长径和短径,按以下公式:瘤体体积(mm3)=长径(mm)×短径(mm)2×0.52计算瘤体体积。③在接种EOMA细胞前1天、接种后6天、13天及20天取实验组裸鼠外周血行血常规检查。④在处死实验组裸鼠前,对肿瘤局部行B超扫查,常规测量肿瘤大小,观察其形态、回声、边界及其深度。启动彩色多普勒血流显像(Color Doppler Flow Imaging, CDFI),了解肿瘤内部及周边的血流分布情况,测量血流速度及阻力指数,并辅以探头加压试验以观察病变的形态及血流信号变化。⑤当实验组中有裸鼠出现嗜睡和行动困难时,所有鼠均予以颈椎脱臼法处死。解剖并切除心脏、肺、肝脏、肾脏、右侧股骨、脾脏和肿瘤组织,并称重脾脏。对各脏器标本行4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,切片及HE染色,病理学光镜检查。⑥在处死裸鼠后,取左侧股骨骨髓,涂片,晾干后行瑞氏染色,最后行光镜观察:计数全片巨核细胞总数,并分类计数25个巨核细胞。 结果:①实验组成瘤率达100%,而对照组无一成瘤。肿瘤形状规则,表面颜色为蓝紫色,周围皮肤颜色正常。肿瘤与周围组织分界清楚,不可推动。随着时间延长,肿瘤体积迅速增大,从接种后7天至21天短短的14天内,肿瘤体积平均增大约30倍。实验组裸鼠出现不同程度的皮肤苍白,其中有2只鼠出现皮肤紫癜,4只鼠肿瘤表面皮肤出现溃疡、出血。实验组与对照组裸鼠从接种前直至处死前,其体重均无差异(P>0.05)。②随着肿瘤的不断增长,实验组裸鼠外周血红细胞(Red blood cell,RBC)计数、血红蛋白量(Hemoglobin concentration)、血细胞比容(Hematocrit,Hct)、血小板(Platelet)计数迅速下降(与接种前比较P<0.01);白细胞(White blood cell,WBC)计数、平均红细胞容积(Mean corpuscular volume,MCV)、平均红细胞血红蛋白量(Mean corpuscular hemoglobin,MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(Mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)与接种前比较无差异(P>0.05)。③骨髓像显示:实验组裸鼠全片巨核细胞总数,分类计数25个巨核细胞中原始巨核细胞、幼稚巨核细胞、颗粒型巨核细胞及裸核型巨核细胞的比例与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组产板型巨核细胞与对照组比较,显著减少(P<0.01)。④超声检查发现8例肿瘤均仅限于皮下,边界清楚,形态较规则,瘤体呈不均质的低回声团块,并有强回声条状分隔;彩色多普勒血流显像(Color Doppler Flow Imaging, CDFI)显示瘤体内以静脉血流为主,部分有低速的动脉血流,探头加压试验阳性。⑤病理学检查发现其中1只实验鼠心、肾、肝肉眼观表面有出血灶,镜检发现其心肌纤维增粗、心肌纤维间见出血灶,肾实质出血,肝实质出血,肺泡腔内出血。其余实验组裸鼠心、肺、肝、肾、骨等器官肉眼观无任何异常,镜检观察均未发现有转移瘤。切除之肿瘤,肉眼观皮肤为蓝紫色,其脏面为暗红色,肿瘤包膜完整,与周围组织分界清楚,镜检发现含众多大小不一的囊腔,腔内充满红细胞,囊壁较厚,为增生的肿瘤细胞构成。这些肿瘤细胞核大,染色深,可见核分裂像。其病理诊断为血管内皮瘤。 结论:成功构建了Kasabach-Merritt综合征裸鼠模型。该模型操作简单、成瘤率高、成瘤周期短,是血管瘤基础和临床研究的良好载体。 第三部分重组人血管内皮抑素治疗裸鼠Kasabach-Merritt综合征的实验研究 目的:观察重组人血管内皮抑素瘤内注射对鼠Kasabach-Merritt综合征的治疗效果,并于临床上常用药物平阳霉素、曲安缩松相比较。 方法:①将40只雌性裸鼠随机分成五组:YH-16治疗组, PYM治疗组,曲安缩松治疗组,PBS对照组,未接种肿瘤组。收集对数生长期的EOMA细胞,调整成1×107/mL活细胞浓度,将100uL细胞悬液接种于裸鼠右侧腰背部皮下。在肿瘤肉眼可见后行瘤内注射治疗,每三天注射一次。②隔日观察肿瘤的生长情况,用游标卡尺记录肿瘤的长径和短径,按以下公式:瘤体体积(mm3)=长径(mm)×短径(mm)2×0.52计算瘤体体积。③在接种EOMA细胞接种后6天、13天及20天取各组裸鼠外周血行血常规检查。④当有裸鼠出现嗜睡和行动困难时,所有鼠均予以颈椎脱臼法处死。解剖并切除肿瘤组织和脾脏,并称重。标本行4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色,病理学光镜检查。⑤在处死裸鼠后,取股骨骨髓,涂片,晾干后行瑞氏染色,最后行光镜观察:计数全片巨核细胞总数,并分类计数25个巨核细胞。 结果:①PYM组瘤体体积在皮下接种EOMA细胞后9天小于PBS组(P<0.05),在接种后11~21天显著小于PBS组(P<0.01)。YH-16组瘤体体积在接种后11~21天显著小于PBS组(P<0.01)。曲安缩松组瘤体体积在接种后15天小于PBS组(P<0.05),在接种后17~21天显著小于PBS组(P<0.01)。在接种后21天,瘤体体积由大到小排列为PBS组>曲安缩松组>YH-16组>PYM组。在接种EOMA细胞后5~21天,曲安缩松组的体重显著小于未接种组(P<0.01),并且随着时间的推移,其体重曲线呈明显的下降趋势。PBS组、PYM组、YH-16组三组的体重未受影响。②PYM组外周血RBC计数、Hb、Hct、Platelet计数在接种后各时间点与未接种组比较无差异(P>0.05),且显著大于PBS组(P<0.01)。YH-16组外周血RBC计数、Hb、Hct、Platelet计数在接种后6天与未接种组比较无差异(P>0.05);在接种后13天,四项指标均低于未接种组(P<0.05);在接种后20天,显著低于未接种组(P<0.01);YH-16组四项指标在接种后各时间点均显著大于PBS组(P<0.01)。曲安缩松组外周血RBC计数、Hb、Hct、Platelet计数在接种后6天与未接种组比较无差异(P>0.05);在接种后13天、20天,曲安缩松组四项指标均显著低于未接种组(P<0.01);曲安缩松组该四项指标在接种后各时间点均显著大于PBS组(P<0.01)。③骨髓像显示:荷瘤组裸鼠全片巨核细胞总数,分类计数25个巨核细胞中原始巨核细胞、幼稚巨核细胞、颗粒型巨核细胞及裸核型巨核细胞的比例与未接种组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。PBS组产板型巨核细胞的比例与未接种组相比,显著减少(P<0.05)。PYM组、YH-16组和曲安缩松组产板型巨核细胞的比例与未接种组相无差异(P>0.05)。④瘤重:PYM组、YH-16组、曲安缩松组均显著轻于PBS组(P<0.01)。各荷瘤组之间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。脾重:未接种组、PYM组、YH-16组、曲安缩松组均显著轻于PBS组(P<0.01)。PYM组与未接种组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。YH-16组、曲安缩松组脾均重于未接种组(P<0.05)。PYM组、YH-16组、曲安缩松组三组两两比较,有显著差异(P<0.05)。肿瘤病理学检查发现PBS组囊腔数量多,囊腔巨大,腔内含血量丰富。PYM组肿瘤细胞数量减少,囊壁破裂、崩塌,囊腔形状尚隐约可见,其内红细胞明显减少。YH-16组囊腔数量减少,体积明显变小,腔内含血量减少。曲安缩松组囊腔体积缩小,但数量未见明显减少,并且可见炎症细胞侵润。 结论: YH-16、PYM瘤内注射能明显抑制Kasabach-Merritt综合征的发展,改善临床症状,且二者的疗效明显优于曲安缩松。……