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H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学系统的建立

刘大飞

   猪流感是世界范围内养殖业常见呼吸道病和免疫抑制病,伴随呼吸困难、咳嗽、流鼻涕、打喷嚏和发热等症状。猪流感一旦暴发,将会给养殖也造成巨大损失,尤其当与其它呼吸道病继发或混合感染,如猪繁殖与呼吸障碍综合征等,损失更是无法估量。猪流感除了其重要的兽医卫生学意义外,更重要的还在于其显而易见的公共卫生学意义。 2004年,从广东省某发生呼吸道病的猪场采集的病料和棉签拭子中分离到一株病毒,病毒接种SPF鸡胚增殖后进行纯化。经血凝抑制试验(HI)和神经氨酸抑制酶试验(NI)鉴定为H1N1亚型SIV,命名为A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)(简称LM株)。测定该病毒EID50为10-6.8/mL,TCID50为10-7.2/mL。 采用RT-PCR技术分别扩增A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)的8个基因片段,分别将其克隆到pMD18-T载体,进行全基因组序列测定。核苷酸序列测定结果显示:LM株SIV各基因片段均未发现核苷酸插入或缺失现象。HA切割位点处的氨基酸序列为IPSIQSR↓G,与高致病性SIV的H1N1亚型毒株的分子特征不符合。HA基因含有8个潜在的N-糖基化位点,6个在HA1的第10、11、23、87、276和287位,增加了2个分别在HA2的154和213位点;NA基因不仅在58,63,68,88和146位含有高度保守的N-糖基化位点,而且在44,235和386位增加了3个潜在的N-糖基化位点,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征。核苷酸同源性结果:HA基因与类人谱系的流感病毒分离株有很高的同源性(99%),而其它基因均与古典猪谱系的流感病毒分离株同源性较高(87%-98%)。从绘制的各个片段进化树和核苷酸同源性分析结果,可以推测该毒株HA基因可能来源于类人谱系的流感病毒;而其它基因来源于古典猪谱系的流感病毒。 序列测定的基础之上,将扩增的8个基因片段分别克隆到pHW2000双向转录表达载体中,构建8个基因的重组阳性质粒。利用绿色荧光蛋白报告基因对聚合酶与核蛋白基因重组质粒活性进行检测,并以A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)作为骨架,检测各个片段的活性。将鉴定有活性的各个片段重组质粒共转染MDCK/293T细胞对病毒进行拯救,首次成功拯救出了全部基因均来自于亲本毒株的重组猪流感病毒rH1N1。rH1N1在鸡胚中增殖后,测定血凝效价为1:64,EID50为10-7.1/mL,TCID50为10-7.6/mL。rH1N1经鸡胚传15代后,对第5、10和15代的HA和NA基因序列测定结果显示,序列均与亲本毒株相应基因完全一致,说明重组病毒有良好的遗传稳定性,该研究为下一步对H1N1亚型猪流感病毒致病机理研究及细胞培养型疫苗的研制奠定了基础。将亲本株的6个内部基因用禽源高产株A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)的内部基因替换,成功拯救出具有高度细胞适应性的重组病毒re-LM,该重组病毒接种MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1:1024,具有高产的特性。用该重组病毒制备的油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,2周即可检测出HI抗体。一免、二免和三免后2周HI抗体平均效价分别为1:32,1:128和1:512。说明该重组病毒有良好的免疫原性。……   
[关键词]:猪流感病毒;反向遗传操作系统;细胞培养型流感疫苗;H1N1亚型
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2008年