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丝素蛋白纳米纤维对神经元和神经胶质细胞生长发育及迁移的支持作用研究

董运海

   中枢神经系统疾病和损伤是目前世界上致死率最高的疾患之一,与外周神经系统损伤相比,中枢神经损伤后由于胶质瘢痕形成及生长抑制因子的作用使其自我再生能力更弱,目前临床治疗的方法还主要局限在自体和异体移植促使神经损伤后轴突的再生,但从术后恢复来看前景并不乐观。随着生物科技的发展,基因工程和生物组织工程方法已开始运用在神经损伤的治疗上,其中利用生物相容性材料辅助中枢神经系统损伤后的修复成为最具开发潜力的方法之一。本文利用丝素蛋白纳米纤维支架作为中枢神经系统终端分化细胞和神经干细胞的生长基质,探讨纤维状丝素支架在神经修复和再生上应用的可能性。 本研究首先在体外培养得到了星形胶质细胞、神经元及神经干细胞,并通过细胞形态、生长特性及特异性抗原表达(GFAP、NCAM、β-Ⅲ-Tubulin及Nestin等)对细胞进行了鉴定。结果显示:(1)通过反复传代的方法纯化了星形胶质细胞(纯度在95%以上);(2)体外培养的神经元具有典型的特征,突起明显,生长状态较好;(3)利用神经干细胞的生长特性,分别尝试了贴壁培养和悬浮培养两种培养方式,Nestin特异性抗原证明两种培养体系下的神经干细胞阳性比例较高,其中贴壁培养的阳性率达到85%,同时分化实验也证明了神经干细胞所具有的多潜能特性。 在保证了种子细胞来源的前提下,实验将星形胶质细胞、神经元及神经干细胞分别和丝素蛋白纳米纤维相结合,研究丝素蛋白纳米纤维对神经终端分化细胞和神经干细胞生长发育和迁移的影响。实验得到如下的结果:(1)星形胶质细胞在两种材料上表现出很高的相容性,星形胶质细胞在丝素蛋白纳米纤维网上具有正常的粘附、增殖和迁移等行为。重要的是,通过实时显微摄像跟踪细胞的生长与迁移行为,我们发现星形胶质细胞的生长与迁移表现出很强的丝素蛋白纳米纤维依赖性,星形胶质细胞在丝素纤维上生长铺展并且沿着纤维进行迁移,纤维的走向决定着细胞的迁移轨迹。(2)原代培养的神经元在丝素蛋白纳米纤维上可以生长发育,细胞的突起明显,且铺展在丝素蛋白纳米纤维上;(3)神经干细胞能够在丝素蛋白纳米纤维上维持未分化特性,同时纳米纤维支持神经干细胞向神经胶质细胞和神经元的分化,分化形成的细胞能够沿着丝素蛋白纳米纤维生长发育,且与对照组相比神经干细胞分化过程中迁移距离和范围更大。以上的实验证明了丝素蛋白静电纺后形成的家蚕、柞蚕或者混纺纳米纤维不仅能够支持星形胶质细胞、神经元以及神经干细胞的粘附、生长发育、分化,而且对细胞的迁移行为还有引导作用,这些特点使得再生丝素蛋白纳米纤维网成为极具开发潜力的神经组织工程替代物,为神经再生、轴突的生长提供良好的胞外环境,同时也说明了将丝素蛋白纳米纤维和神经类种子细胞结合后治疗神经性缺陷和损伤的可能性。 同时实验为了进一步佐证丝素蛋白纳米纤维对中枢神经系统细胞生长发育和迁移的支持作用,直接将大鼠大脑皮层组织薄片培养在丝素蛋白纳米纤维上,利用试剂染色检测发现:丝素蛋白纳米纤维支架能支持脑薄片贴附,并随着体外培养时间的延长,大量具有活性的细胞从组织片内沿纤维材料迁出,组织片以纳米材料为支架相互之间构成了错综复杂的神经网络结构。由此可以看到,丝素蛋白纳米纤维对脑片表现出较好的生物相容性,这就为今后的体内实验提供了重要的参考价值。 本实验不仅成功的建立了神经终端分化细胞和神经干细胞的体外培养平台,同时将丝素蛋白纳米纤维作为此类细胞的生长基质,研究不仅证明了丝素纤维材料能够支持神经胶质细胞、神经元、神经干细胞以及脑薄片的贴附、生长和发育,而且对中枢神经系统内的细胞迁移运动具有引导作用,这些结论的得出使得极具开发潜力的再生丝素蛋白纳米纤维辅助神经再生以及充当神经组织工程替代物成为可能。……   
[关键词]:神经类细胞;丝素蛋白;生长发育;细胞迁移;生物相容性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:苏州大学2008年