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促血管生成素-2在毕赤酵母中的分泌表达及功能研究

周磊磊

   血管新生是产生新的血管的过程,参与胚胎发生、创伤愈合和肿瘤发生等多种生理过程,起着非常重要的作用。血管新生在体内是受促血管生成因子和抑血管生成因子的平衡严格控制的过程,是一种受多种信号途径的调控的复杂过程。促血管生成素家族在血管生成中起重要的作用。促血管生成素-2是其中的一类成员,它参与生理和病理性的血管新生,与肿瘤、动脉粥样硬化和哮喘其他疾病有密切的关系。 促血管生成素-2具有促血管生成素的典型结构,由两个结构域组成:接近N端的卷曲螺旋结构域( coiled-coil domain )和类纤维蛋白原结构域(fibrinogen-like domain, FL)。其中类纤维蛋白原结构域与促血管生成素-2的生物学功能密切相关,主要负责与受体结合。促血管生成素-2最初被认为是Tie-2的拮抗物,竞争性与Tie-2受体结合抑制促血管生成素-1对Tie-2受体的磷酸化。然而,最近有些研究显示,促血管生成素-2即可以作为Tie-2受体激动剂,也可作为Tie-2受体拮抗物。低浓度时,促血管生成素-2不会激活Tie-2受体,高浓度时,则激活Tie-2受体使其自磷酸化。 促血管生成素-2的研究不断深入,人们对其表达的兴趣不断增高。在国外,人们采用多种表达系统来尝试对其进行表达。但是他们要么是采用昆虫细胞表达系统,要么是采用COS、A10 SMC、293T等哺乳动物细胞来进行表达。但是往往是瞬时表达,表达量很低。原因可能在于,促血管生成素-2的卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain)易于聚合,容易导致蛋白的不可溶。大量的高效的制备促血管生成素-2成为了其研究的制约因素。 本研究PCR扩增得到全长的促血管生成素-2序列,把其构建到pBV220等质粒上,转化到大肠杆菌中进行了表达研究。我们采用了不同的表达菌株和培养条件进行表达,但是发现促血管生成素-2由于其结构和密码子偏性等问题很难在大肠杆菌中进行表达。于是,我们将促血管生成素-2基因构建到酵母表达载体pPICZɑA上,构建了pPICZαA/ Ang-2毕赤酵母表达载体,再转化到毕赤酵母菌株GS115和KM71H中,并从KM71H的重组子中筛选到了高效表达株K1,优化并确定了最适发酵条件。采用HisTrap亲和层析法对His标签的重组促血管生成素-2进行了纯化。细胞MTT试验研究显示,重组促血管生成素-2在低浓度(0~0.2μg /ml)时对ECV304细胞没有影响,浓度为1μg/ml时,重组蛋白对ECV304细胞株开始有促增殖作用,并且随着浓度的增加其对ECV304的效应不断增强。当浓度为2μg/ml,对ECV304的效应达到最强,随后有所下降,趋于稳定。此研究实现了促血管生成素-2的高效的表达,为进一步研究促血管生成素-2的生物学功能打下了基础。 为了研究促血管生成素-2的其它的可能功能,我们把促血管生成素-2序列构建到酵母双杂交载体pAS2-1上,转入酵母Y190菌株中,并用Western blot鉴定了其在酵母细胞内的表达,最后在胎肝cDNA文库里进行了筛选。此研究为进一步研究促血管生成素-2其它功能提供了条件。……   
[关键词]:促血管生成素-2;毕赤酵母;分泌表达;酵母双杂交
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军事医学科学院2008年
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