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土耳其斯坦东毕吸虫分子种系发生的研究

李利

   土耳其斯坦东毕吸虫(Orientobilharzia turkestanicum)是寄生于牛、羊等多种动物门静脉和肠系膜静脉的一种血吸虫。它与所在属内的其它血吸虫寄生于动物导致的疾病称为东毕吸虫病(orientobilharziasis),主要分布于亚洲和欧洲的一些国家和地区,常呈地方性流行,对畜牧业危害十分严重。近年来,土耳其斯坦东毕吸虫的研究主要集中在其形态特征描述、生活史研究及东毕吸虫病的流行病学调查、诊断、药物防治和预防措施等方面,关于其分子分类和种系发生的基础研究少见报道。核糖体DNA是细胞核内编码核糖体RNA的基因,为一类中度重复序列,以串联多拷贝的形式存在于细胞核内染色体DNA中,每个重复单位由非转录间隔区(non-transcribed spacer regions, NTS)、内部转录间隔区(internal transcribed spacer region, ITS)和3种核糖体基因编码区(18S、5.8S、28S)组成,不同区域其进化速率不同。线粒体为母系遗传,其基因间很少重组,所以可以反映出母系的进化历史,这样线粒体一个基因就可以代表整个线粒体基因组的变异情况。因此,我们以土耳其斯坦东毕吸虫核糖体内转录间隔区(ITS)序列、28S核糖体DNA大亚基序列(28S ribosomal DNA large-subunit sequences, 28S rDNA-LSU)、线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(cytochrome c oxidase subunit 1 gene, cox1)基因和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1(nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 1 gene, nad1)基因为研究对象,对目的片段进行克隆和序列测定,构建分子系统发生树,探讨土耳其斯坦东毕吸虫在裂体科中的系统发生位置。 从自然感染黄牛、绵羊、绒山羊和山羊的肝门静脉及肠系膜静脉内采集虫体,经形态学鉴定为土耳其斯坦东毕吸虫。以SDS-蛋白酶K法抽提不同终末宿主的土耳其斯坦东毕吸虫基因组DNA,根据GenBank上发表的土耳其斯坦东毕吸虫及相关血吸虫序列,利用Oligo6.0软件设计特异引物,PCR扩增ITS区序列、28S rDNA-LSU序列、线粒体cox1基因和nad1基因,扩增产物经纯化后克隆于pMD18-T载体,转化到JM109感受态细胞,提取质粒DNA,经PCR和双酶切鉴定后,阳性质粒测序,应用DNAStar软件比较不同终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫核苷酸序列的同源性,并应用DNAMAN软件分析28S rDNA-LSU序列RNA二级结构的改变情况。检索GenBank,查找血吸虫相关基因序列,应用Clustal X1.83软件对相关序列进行排序,提交引导树,使用MEGA软件采用邻接法(neighbor-joining method, NJ)和最大简约法(maximum parsimony method, MP),绘制系统发生树。序列分析结果表明,土耳其斯坦东毕吸虫核糖体ITS区序列、28S rDNA-LSU序列、线粒体cox1编码基因、nad1编码基因大小分别为874 bp,1 304 bp,1 125 bp和518 bp;不同终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫ITS区序列、28S rDNA-LSU序列、cox1基因序列和nad1基因序列存不同程度的差异,绵羊、绒山羊和山羊源土耳其斯坦东毕吸虫28S rDNA-LSU序列RNA二级结构相同或相似,黄牛源与羊源土耳其斯坦东毕吸虫28S rDNA-LSU序列RNA二级结构存在较大差异。以肝片形吸虫作外群,基于核糖体ITS区序列、28S rDNA-LSU序列、线粒体cox1基因序列和nad1基因序列采用NJ法和MP法构建的系统发生树,其结果一致,均显示土耳其斯坦东毕吸虫的分类地位处于裂体属内,同时土耳其斯坦东毕吸虫归属非洲血吸虫种群。……   
[关键词]:土耳其斯坦东毕吸虫;线粒体基因;核糖体基因;分子种系
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:黑龙江八一农垦大学2008年
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