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四种植物病毒单克隆抗体和传染性法氏囊病病毒疫苗研制及应用

吴建祥

   一、传染性法氏囊病病毒VP2蛋白在水稻稻米中的表达及其免疫原性和免疫保护性 传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)能引起鸡群以免疫抑制为特征的急性接触性传染病,且该病毒造成鸡群对其它病原的易感性增强和免疫失败,给养禽业带来巨大的经济损失。由于自上世纪80年代开始出现IBDV变异株和超强毒株,使传统的灭活苗和弱毒苗防治逐渐失去意义。且传统的疫苗存在许多不足,如灭活苗存在昂贵、低效、免疫麻烦,而弱毒苗由于基因重组产生IBDV新的变异株等。因此,研究安全、廉价、有效的新型疫苗对于预防传染性法氏囊病(IBD)十分必要。为了研究水稻作为生物反应器表达IBDV VP2蛋白及表达的重组蛋白用于IBDV亚单位疫苗的可行性,我们进行了IBDV VP2在转基因水稻稻米中特异性表达。 用PCR方法克隆水稻GluA-2基因的1920bp的Gt1启动子,并用该启动子替换pCambial301-35S的35S启动子构建成水稻胚乳特异性表达载体pCambial301-Gt1。将鸡传染性法氏囊病病毒(ZJ2000分离株)VP2基因定向插入上述构建的植物表达载体的水稻胚乳特异性启动子GT1下游,构建成重组表达载体pCambial301-Gt1-VP2,重组表达载体经三亲交配导入EHA105根癌土壤杆菌中。利用根癌土壤杆菌介导系统转化粳稻品种秀水11成熟胚愈伤。PCR和Southern blot检测证明121株再生水稻基因组内已整合IBDV VP2基因,转化率达到20%。所有的转基因水稻在温室中成熟结籽。TAS-ELISA分析表明不同转基因稻米中表达不同水平的VP2蛋白,占可溶性总蛋白的0.678%-4.521%之间。Western-blot分析表明,转基因水稻稻米提取物中有一分子量约50 kDa的条带与IBDV的抗血清反应,但不同转基因稻米的反应条带的颜色深浅及大小不同,进一步说明VP2蛋白在转基因水稻稻米中表达量不一。 转基因稻米免疫后的鸡用IBDV强毒(BC6/85株)攻毒,攻毒后第7天扑杀并剖检,眼观病变、囊体比值、组织切片病理学观察表明,高剂量免疫鸡(口服免疫5 g转基因水稻稻米)的免疫保护率为83.33%(5/6),但随着免疫剂量减到3 g、1 g时,其免疫保护率也分别降为33.33%(2/6)和16.67%(1/6)。免疫鸡的中和抗体效价分析表明高剂量的免疫鸡产生高效价的中和抗体,但中和抗体效价随着免疫剂量的减少而下降,即中和抗体效价存在剂量依赖关系。这些结果表明转基因水稻稻米表达的IBDV VP2蛋白能在免疫鸡体内产生强烈的免疫反应,并诱导产生高水平IBDV中和抗体,具有良好的免疫原性和免疫保护性。将二周龄的小鸡每天每只口服免疫25 g转基因稻米一个月,在观察的两个月内没有发生死亡、副作用及任何疾病症状。转基因稻米组的平均体重(3.12 kg)与免疫25 g非转基因稻米对照组(3.20 kg)没有显著差异,表明转基因水稻稻米表达的VP2蛋白可作为有效、安全、廉价的IBDV亚单位疫苗。 二、四种病毒的单克隆抗体研制及其应用 番茄斑萎病毒(Tomato spotted wild virus,TSWV)是番茄斑萎病毒属的典型成员,已在世界范围内的许多重要的观赏植物及蔬菜植物上引起巨大损失。该病毒主要由蓟马传播,可感染1000多种单子叶和双子叶植物。用RT-PCR方法从TSWV OiGpTs1分离物中克隆到编码约29 kDa的核衣壳蛋白基因(N基因,777 bp)。利用原核表达系统pET-32a在大肠杆菌中表达了TSWVN蛋白,并用Western blot方法进行了表达蛋白的鉴定。用Ni~(2+)-NTA树脂亲和纯化了重组TSWV N蛋白。以重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤细胞技术制备了3株能够稳定传代并分泌抗TSWV N蛋白及TSWV病毒粒子的单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,并制备了单克隆抗体腹水。Western blot分析表明,3株单克隆抗体与TSWV 29 kDa的核衣壳蛋白有特异性反应。利用这些单克隆抗体建立了检测TSWV的TAS-ELISA和免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)方法。用建立的TAS-ELISA方法对浙江和云南部分地区的烟草、辣椒、番茄等田间发病的250份样品进行检测,检测结果表明样品中没有发现TSWV的侵染。用制备的单抗及TSWV N蛋白的特异性引物进行的IC-RT-PCT试验中阳性对照样品能产生一条约777 bp长的N基因特异性条带,且IC-RT-PCR的有效性及可靠性用基因测序进一步证实。 用提纯的香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得5株能稳定传代并分泌抗CarMV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞,并分别制备它们的单克隆抗体腹水。5株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10~(-6)。Western blot分析表明,5株单克隆抗体均与CarMV 38 kDa的外壳蛋白亚基有特异反应。利用2A9单抗建立ACP-ELISA检测CarMV方法,病叶1:800倍稀释、提纯CarMV病毒浓度为1 ng/mL(绝对检测量为0.1 ng)时仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA对田间香石竹样品的检测表明,CarMV在香石竹上发病很普遍。 用提纯的马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗PVX单克隆抗体的杂交瘤细胞2812和4E7,并分别制备它们的单抗腹水。2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价在10~(-6)以上。利用这些单克隆抗体建立了ACP-ELISA检测PVX的方法。病叶经1:600倍稀释、提纯PVX病毒浓度为2 ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.2 ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA方法测定了田间样品,发现PVX在马铃薯上发病很普遍。 用提纯的百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗LSV单克隆抗体的杂交瘤细胞(2A2、5H9、5H2和5E12),并分别制备它们的单抗腹水。4株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10~(-6),5H9和5E12的抗体类型及亚类均为IgG1,而2A2和5H2均为IgG3,4株单克隆抗体的轻链均为κ链。Western blot分析表明,4株抗LSV单克隆抗体均与LSV 32 kDa的外壳蛋白亚基有特异反应。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测LSV的方法。病叶作1:300倍稀释、提纯LSV病毒浓度为18 ng/mL(每孔的病毒绝对量为1.8 ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA检测了田间样品,发现LSV在百合上发病率很高。……