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丹参病毒病原鉴定与脱病毒技术研究

谢晓亮

   丹参(Salvia miltorrhiza Bge.)为唇形科(Labiatae Juss)鼠尾草属(SalviaL)多年生草本药用植物,以根入药,是我国一种常用大宗中草药,主要用于治疗心脑血管系统疾病。河北是丹参药材主产区之一,年种植面积较大。近年来发现,丹参上有一种病毒引起丹参退化,该病田间发病率较高,有些田块发病率竞高达60-80%,表现为花叶、斑驳、卷叶、黄化、矮化等典型症状。感病植株的根系细小,产量大幅度下降,药用成分含量降低。经抽查分析发现:安国栽培丹参药用成分丹参酮ⅡA含量平均值仅为0.135%,低于国家《药典》0.2%的规定标准,不属于优质丹参。病毒感染、品种退化是造成丹参质量差、产量低、病害严重的主要原因之一,而国内外至今没有关于丹参病毒病害方面的研究报道。目前,病毒病害基本没有有效的药剂可以防治,查明丹参病毒病原,脱除病毒,进行提纯复壮,是防治丹参病毒病害,从根本上提高丹参产量、质量的有效措施,也是生产上迫切需要解决的问题。 本项研究主要分丹参病毒病原鉴定、脱病毒技术建立、脱毒丹参农艺性状比较评价三个部分: Ⅰ.通过生物学鉴定、电镜观察和DAS-ELISA检测,初步确定与丹参病毒病相关的病毒。进而对该病毒病进行了分子生物学研究,克隆病毒基因并进行序列分析,确定病毒病原。根据国际病毒分类原则确定其分类地位;同时,针对特异基因组序列设计引物,建立起该病毒的RT-PCR分子检测技术。 Ⅱ.脱病毒研究,切取大田丹参植株顶芽,接种获得丹参组培苗;切取根段,诱导愈伤,获得丹参愈伤组织。利用常规热处理和茎尖培养相结合的方法,以及微细胞团块诱导再生的方法进行脱除丹参病毒技术研究,检测确定脱毒株系;在此基础上,开展脱毒丹参组培快繁技术研究,建立起丹参脱毒种苗快速繁育技术体系,批量生产脱毒丹参种苗。 Ⅲ.对脱病毒丹参进行农艺性状、生药学性状的比较评价。通过对脱毒丹参和未脱毒丹参在生长发育习性、苗期性状、生物学特性、产量性状、生药学性状以及药用成分等方面的比较分析,明确脱毒丹参性状表现。 研究结果: 1、生物摩擦接种表明,在指示植物白肋烟(Nicotiana tabacum-White Burley.)表现系统花叶、褪绿斑,三生烟(N.tabacum-Samsun)植株表现局部枯斑、卷叶系统症状,表明丹参大田病症,可以通过机械接种传播,不是生理病害,是病毒病害。大田病症和在指示植物上的病症表现与CMV(黄瓜花叶病毒)的致病症状报道较一致;电镜观测病毒粒子形态为颗粒状病毒,病毒粒子直径约29-30nm,与CMV病毒粒子相近,初步确认侵染丹参的病毒与黄瓜花叶病毒密切相关;CMV抗血清DAS-ELISA检测发现,15个丹参样品中10个呈现阳性,由此,确定侵染丹参的病毒为黄瓜花叶病毒(CMV)。 2、通过对丹参CMV病毒进行外壳蛋白基因克隆和序列分析表明,证明丹参病毒确为CMV病毒一个新的株系,该基因被国际基因库收录(国际基因库收录号:AY600989),为具有自主知识产权的基因。根据病毒命名原则,将其命名的CMV—DS株系(黄瓜花叶病毒丹参株系),该研究成果为丹参脱毒和丹参抗病毒基因工程研究奠定了基础。 3、创立了“微细胞团快再生法脱除丹参病毒新技术”,脱除了丹参病毒,脱毒率达75%以上,该技术2006年9月申报了国家发明专利,专利登记号为:200610048342.6。该技术解决了丹参采用常规脱毒不耐高温热处理问题,大大提高了丹参脱毒效率。同时,这种思路和方法可为其它植物脱病毒提供借鉴。 4、建立了脱毒丹参组培快繁技术体系:丹参茎尖诱导不定芽的初代培养基为MS+BA1.5mg/L+IBA0.02 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L,pH5.8;丛生芽分化最适宜培养基为MS+BA1.0 mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L,pH5.8;生根最适宜培养基为1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH5.8;试管苗炼苗适宜基质为蛭石;培养条件为温度25-28℃,光照2000—3000Lx培养,芽体在分化培养基上25~30天继代一次,芽增殖系数基本保持在6.0以上,瓶苗接种到生根培养基上一般20天即可全部生根;炼苗方法是将蛭石基质经0.1%高锰酸钾彻底消毒,洗净丹参瓶苗根部培养基后移栽到蛭石基质上炼苗30天,然后控制水分1—2周,使根老化。炼苗期间每3~5天喷施多菌灵或甲基托布津等杀菌剂一次,防止病菌感染。炼苗温度20~30℃,湿度90%以上。按上述优化条件,组培生产丹参脱毒苗5万株。 5、脱毒丹参产量明显提高:脱毒丹参与未脱毒丹参生物学特性、生育期基本一致。脱毒丹参苗大田栽植后,生长整齐一致,地下部根膨大速度快,根条均匀、商品根多,生药学性状好。脱病毒丹参从地下根数、根粗、单株根重、有效成分含量上都优于未脱毒丹参,试验小区产量比较表明,脱毒丹参产量比对照提高了86%。 6、脱毒丹参药用成分丹参酮ⅡA含量明显提高:脱毒丹参与对照未脱毒丹参生药学性状基本一致,药用成分丹参酮ⅡA含量平均为0.376%,对照未脱毒丹参平均为0.192%,脱毒丹参药用成分丹参酮ⅡA含量比《药典》0.2%标准提高了88%,比对照提高了95.8%,是对照未脱毒丹参的2倍左右。脱毒丹参的推广应用,对从根本上解决大田丹参药材含量不符合《药典》标准的问题奠定了基础。……   
[关键词]:丹参;病毒病原;CMV;外壳蛋白基因;脱病毒;丹参酮ⅡA
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:北京林业大学2008年