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激光诱导荧光DNA分析系统的研究

汪洁

   DNA分析技术是从生物的分子—基因水平揭示生物的特性,它为生命科学研究提供了最有效、最便捷的技术和手段。因此,DNA分析仪器的研究十分重要,它是获取信息的源头和基础。本论文开展了激光诱导荧光DNA分析系统的相关理论和研制工作,先后完成了两套检测系统的设计与构建。它们是基于微通道毛细管电泳技术的现代光学检测系统,具有结构简单、性能良好、成本较低的优点,分辨率达到1bp,也就是单碱基分辨。灵敏度高,对标准DNA样品pGEM-3Zf(+)/HaeⅢMarkers的检测限是2.4×10~(-11)mol/L。满足测序和短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分型对分辨率和灵敏度的要求。主要工作包括两大部分:微通道毛细管电泳部分和激光诱导荧光检测部分。 电泳部分主要包括:对微通道内壁进行改性,以控制电渗流和抑制吸附;制备性能良好的筛分介质能够对样品电泳分离;对涂层、灌胶、进样系统以及荧光染料的选择进行优化,选用非交联的线性聚丙烯酰胺(Linear Polyacrylamide,LPA)作为涂层材料和可替换的筛分介质;测量得到的自制涂层管的电渗流淌度为2.5165×10~(-8)m~2V~(-1)s~(-1),对电渗流的控制满足DNA样品分离的要求;研究了电场强度与迁移率的关系,得到电场强度与电泳电流的关系曲线;对于本筛分系统,提出了一种新的Ogston修正模型,从而能够简单、良好地解释实验结果;考察了DNA样品中不同长度的片段在不同浓度筛分介质中,随电场强度条件变化的信号强度、展宽和分辨率的变化情况,优化筛分质浓度为4%LPA。 检测部分设计为共焦光路,建立了分别以488nmAr+激光器和532nm固体激光器为光源的两套系统,由激光器激发电泳到检测窗口的DNA片段(标记有荧光染料),发射的荧光信号由光电倍增管收集检测,激发光路和收集光路三维可调。通过理论分析和实验优化本系统的设计:优化聚焦于微通道中的激发光斑大小,增大聚焦到毛细管内径中的激发光斑尺寸,使光斑尺寸由最小的10μm增大到50μm(充满了整个毛细管内径),光电倍增管接收到的荧光信号提高了2-3倍,从而提高系统的信噪比和灵敏度;提出在聚焦物镜处加折射率匹配液的方法,加匹配液后的荧光信号得到了增强,因而提高了荧光收集效率和灵敏度。通过理论和实验分析阵列毛细管电泳技术中杂散光的强度与分布,激发光束直接照射到毛细管的内径中心时,毛细管产生的杂散光强度是无毛细管的情况下的2.7025倍;对不同内径的微通道毛细管进行比较,优化内径为50μm;分析了不同间距的阵列毛细管杂散光情况;所得结果对提高检测系统荧光收集效率、提高信噪比、采取最佳扫描方式十分有意义。……   
[关键词]:激光诱导荧光检测;DNA分析系统;微通道;毛细管电泳
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2007年