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重组大肠杆菌生产基因治疗质粒DNA发酵工艺研究

郑淑真

   质粒DNA作为生物药剂(尤其作为基因治疗和基因疫苗的载体)的意义和需求越来越大。质粒DNA作为一种新的非病毒转基因载体,优点是安全可靠、稳定、对外源基因的容纳量大、不会引起免疫系统反应及易于生产等。随着基因治疗和DNA疫苗从实验室进入临床研究和批准上市,必须开发出一个重复性高、易于放大的质粒生产工艺,从而大量生产可作为生物药剂的质粒DNA。 本文对利用重组大肠杆菌(E.coli DH5α/)发酵生产质粒pUK21CMVβ1.2的培养基及发酵工艺进行系统的研究。首先考察培养时间、转接次数和选择压力对质粒稳定性及产量的影响,结果表明重组菌在LB培养基中的最佳质粒收获时间为13h,选择性压力对质粒稳定性及产量影响较小,质粒具有较好的结构稳定性和分离稳定性。 对重组大肠杆菌培养基中碳、氮源和碳氮比等因素进行优化,结果表明蔗糖、酪蛋白胨分别为最佳碳源、氮源,最佳碳氮比为3.82:1。在单因素优化基础上采用Box-Behnken设计法和RSM响应面分析法确定出质粒生产的最佳培养基组成为:酪蛋白胨(10.42 g L~(-1)),蔗糖(9.96 g L~(-1)),氯化钠(10 g L~(-1)),酵母粉(5 g L~(-1)),硫酸铵(6.4 g~(-1)),甘油(9.80 g L~(-1))。采用优化后的培养基摇瓶培养24 h,质粒的产量和生物量分别达到51.80 mg L~(-1)和2.57 g L~(-1),分别是初始LB培养基的3.54倍和2.5倍。 采用2 L Braun发酵罐,首先对流加时期和流加物质进行考察,结果表明对数期流加葡萄糖和优化培养基均对菌体生长产生抑制,对质粒产量没有明显的促进作用。稳定期流加葡萄糖对菌体生长无促进作用,对质粒产量有一定促进作用;而稳定期流加优化培养基对菌体生长和质粒生产没有明显的促进作用。pH-stat流加方式可大大提高菌体的比生长速率和质粒的产量,当采用2×优化培养基恒pH值发酵时,最大质粒产量和生物量分别达到601.9 mg L~(-1)和16.78 g L~(-1),分别是间歇培养的6.63倍和2.53倍。……   
[关键词]:质粒DNA;重组大肠杆菌;培养基;发酵;流加
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:厦门大学2007年