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百合LlACO1基因克隆与遗传转化受体系统的建立

许洁婷

   百合(Lilium)是世界上的五大鲜切花之一,深受人们的喜爱。但是,百合与其它鲜切花一样随着花朵的开放而迅速衰老,如何延长百合花朵的保鲜期已成为近二三十年来百合研究的热点。据研究报道,百合花的衰老与乙烯的产生有关,而ACC氧化酶是乙烯生物合成途径中的一个关键酶,克隆百合ACC氧化酶基因(ACO)并进行调控研究和探索,利用基因工程技术改良百合保鲜期具有重要意义。 本研究以麝香百合为材料,克隆了百合ACO基因并对基因进行了表达分析,进而在ACO反义载体构建、百合遗传转化受体系统建立及农杆菌介导外源基因转化等方面开展一系列工作,取得了以下结果: 1.首次从麝香百合中克隆到了ACC氧化酶基因LlACO1的cDNA全长序列(Genbank No. EU249333)。LlACO1 cDNA全长为1,067 bp,带一短poly(A)尾巴,包含26 bp的5’非翻译区(UTR)和91 bp的3’非翻译区,以及954 bp长的开放读码框(ORF),推导其编码一个含317氨基酸残基、分子量为36.18 kDa、等电点(pI)为5.26的蛋白质。 对LlACO1氨基酸序列进行生物信息学分析和蛋白质结构预测,结果显示,LlACO1与郁金香的同源性最高(86%),其蛋白质序列和结构比较保守,不同物种间的差异不大;具有与oxgenase家族的功能域同源的结构域,在进化关系上与郁金香、兰花等比较近。组织特异表达分析结果表明LlACO1在百合不同器官中的表达有差异。 2.首次从麝香百合基因组中克隆得到了LlACO1全长序列。该基因含有4个外显子和3个内含子。内含子分别位于nt132-312、nt 618-969、nt 1342-1671、大小分别为181bp,79bp,330bp。Southern杂交分析结果表明LlACO1在百合基因组中呈低拷贝分布。 3.建立了百合遗传转化愈伤组织受体系统。以麝香百合幼嫩花部组织为材料,研究筛选出了花丝做为最佳的诱导愈伤组织的外植体,并筛选出了最佳的诱导培养基、增殖培养基、分化培养基和生根培养基,确立了卡那霉素和潮霉素对百合愈伤组织的最佳筛选浓度,为百合的遗传转化奠定了基础。 4.构建了LlACO1的反义表达载体。利用酶切和连接技术把LlACO1的反义片段antiLlACO1连接到pCAMBIA1304上,并保留了gus报告基因。将载体质粒转化至农杆菌EHA105菌种中,获得了用于百合转化的含antiLlACO1的工程菌。 5.利用农杆菌介导法对麝香百合进行了遗传转化,利用GUS染色法研究了外源基因在受体愈伤组织中的瞬时表达,并通过潮霉素筛选及分化诱导获得了一批具有潮霉素抗性的愈伤组织和再生植株。……   
[关键词]:麝香百合;ACC氧化酶;愈伤组织;卡那霉素;潮霉素;植物反义表达载体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:上海交通大学2008年