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日本血吸虫性别差异表达基因的筛选及新基因的克隆分析

夏艳勋

   血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。血吸虫为吸虫中罕见的雌雄异体,性别的分化对血吸虫的发育及致病起着至关重要的作用。雌雄虫合抱是血吸虫雌虫发育成熟和产卵的关键,成熟雌虫所产生大量虫卵而引起肝脏病变是造成宿主主要病理损害和疾病再传播的前提。基于此本论文开展了日本血吸虫性别差异表达基因的筛选研究,并对部分差异表达新基因进行了克隆分析,以探索血吸虫性别发育的分子机理,开拓免疫预防新途径。 应用抑制性消减杂交技术构建了日本血吸虫雄虫和雌虫的消减杂交文库。消减效率分析表明同源基因经过消减杂交后得到了有效扣除,消减效率较高;重组比率及插入片断长度分析结果表明雌虫消减文库的重组比率为92%,且85%的插入片断大于500bp;雄虫消减文库的重组比率为91%,且90%以上的插入片断大于500bp;对构建的日本血吸虫雌雄虫消减库随机挑选部分克隆测序,分别获得64条雌虫EST序列和62条雄虫EST序列。同源性搜索结果表明分别代表了45和48个日本血吸虫基因,雌虫和雄虫消减文库的冗余率分别为29.7%和22.6%;所测EST序列共有25条与12种血吸虫已知基因匹配,其中雌虫消减文库中与血吸虫已知基因高度同源的有日本血吸虫卵壳蛋白、卵黄铁蛋白Ferrtin-1、fs800等基因。雄虫消减文库与已知血吸虫基因高度同源的有肌动蛋白、原肌球蛋白等基因。这几种血吸虫基因已经被证实为性别差异表达基因,结果表明本研究所构建的日本血吸虫性别差异消减文库质量较高,可以用于性别差异表达基因的筛选研究。 利用cDNA微阵列技术在整个基因组水平上对日本血吸虫性别差异表达基因进行筛选。从构建好的雌虫和雄虫两个消减文库中共挑选3072个克隆制成cDNA微阵列。芯片杂交后获得953个雌虫高表达和1014个雄虫高表达的基因克隆。其中855个克隆经测序分析代表297个单基因,雌雄虫分别为137个和160个。序列同源性搜索结果表明:297个单基因中,247个与已知EST有95%~100%同源性;雌虫所代表的137个单基因中,蛋白功能已知的血吸虫基因有18个,蛋白功能未知的血吸虫基因96个,与已知EST高度同源的基因13个,其它物种基因2个,没有同源性的新EST 8个。雄虫所代表的160个血吸虫单基因中,蛋白功能已知的血吸虫基因30个,蛋白功能未知的血吸虫基因109个,与已知EST高度同源的基因15个,其它物种基因1个,没有同源性的新EST 5个。从中选取7个非冗余的差异表达基因克隆,用实时定量PCR进行了验证,证明上述克隆确为血吸虫性别差异表达的基因克隆,与芯片杂交结果一致。所测EST编码蛋白的功能预测结果显示:雌虫消减文库中与已知血吸虫基因高度同源的有卵壳蛋白、卵黄铁蛋白、fs800、RXR受体、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L、过氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶等,提示多与血吸虫的产卵、能量代谢、转录调节及抗氧化反应相关。雄虫消减文库与已知血吸虫基因高度同源的有肌动蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白、胶原、22.6ku膜蛋白、23ku膜蛋白、钙蛋白酶、calponin、钙调蛋白、钙网蛋白、热激蛋白HSP60、HSP70、HSP90等。EST的编码蛋白功能预测结果提示这类基因多为虫体的结构蛋白与虫体运动相关蛋白,参与离子调节与信号转导、蛋白质的合成、转运及分解代谢等。 应用RACE技术扩增了4个血吸虫全长新基因cDNA。并利用生物信息学分析工具对新基因编码蛋白的理化性质、跨膜结构、抗原位点进行了分析预测,对编码蛋白的保守功能域、结构位点及其同源性蛋白进行了搜索。结果显示雌虫高表达f2基因编码蛋白具有泛素和核糖体蛋白S30e的保守功能域。雄虫高表达cm3基因编码蛋白具有C2H2型锌指结构的保守功能域,cm4编码蛋白具有SPla/RYanodine receptor SPRY结构域。m1基因编码蛋白可能是一种血吸虫特有蛋白。对新基因生物学功能的深入研究,对于探索血吸虫性别发育的分子机制、开发高效候选疫苗和药物新靶标具有重要价值。……   
[关键词]:日本血吸虫;性别差异表达;新基因;抑制性消减杂交;cDNA微阵列;RACE
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华南农业大学2006年