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烟草EST-SSR标记的建立及其应用

赵世浩

   烟草(Nicotiana tabacum)为茄科(Solanaceae)烟属(Nicotiana)一年或多年生作物,被认为起源南美洲,现已成为一种世界性的重要经济作物,是最早应用于分子生物和基因工程研究的模式植物之一。我国是世界上最大的烟草生产国,但烟草育种面临亲本匮乏、品种遗传背景狭窄、盲目性、重复性大等问题。近年来分子标记等分子生物技术在烟草领域应用中的研究,取得了一定进展。SSR分子标记技术是90年代兴起的一种分子标记,微卫星在染色体上分布均匀,数量也多,具有高度的变异,多态性信息非常丰富等优点被迅速且广泛地运用于生命科学的各领域中。利用现有生物数据库中的烟草EST资源,在了解烟草EST中SSR的信息的基础上,首次建立了EST-SSR标记,同时对其在品种资源分析中的应用进行了探讨。主要研究结果如下: 1、明确了烟草EST中SSR的频率及特性。利用生物信息学方法在含有40666条烟草EST序列的数据库中进行微卫星标记筛选,共发现微卫星序列3685个,占整个EST数据库的9.062%。其中双碱基重复序列2614个、三碱基序列1019个,分别占在EST数据库中发现微卫星序列的70.936%和27.652%。烟草EST-SSR中,二核苷酸重复是主要的重复类型,出现最多的重复基元是AG/CT重复。烟草EST中SSR信息的明确为进一步建立和应用EST-SSR标记奠定了基础。 2、建立了烟草EST-SSR标记。以烤烟品种K326为材料,研究了烟草EST-SSR分析中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。结果表明:在总体积为20μL的PCR反应中,含25ng模板DNA,1.5U Taq DNA聚合酶,MgCl_2终浓度为1.5mmol·L~(-1),dNTPs浓度为200μmol·L~(-1),引物浓度为0.05μmol·L~(-1)时效果较好。根据筛选到的微卫星序列设计并合成引物50对,其中30对引物有扩增产物,23对产物条带比较清晰。 3、本文应用EST-SSR标记,对烟草属2个种6份材料的遗传多样性进行了分析。从50对SSR引物中共筛选出15个多态性明显、条带清晰、反应稳定的引物,6个样品DNA共扩增出91条谱带,平均每对引物扩增出6.06条谱带,多态性条带比率达51.04%。种间遗传相似系数在0.2681~0.9411之间,平均为0.6046,表现出丰富的遗传多态性。红花种的4个栽培品种之间的遗传相似系数较高,在0.5277~0.9411之间,其中来自美国的G80和革新五号遗传相似系数最高,为0.9411,揭示了烟草栽培种内品种间的遗传基础相对较狭窄。黄花93-1烟草与其它供试材料间的遗传相似系数较低,在0.2681~0.3713之间,揭示出烟草野生种与栽培种不同类型间存在较大的遗传差异性。这些结果说明利用EST-SSR标记对烟草资源评价是有效的。……   
[关键词]:烟草;EST;SSR信息;标记建立;资源分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:湖南农业大学2007年