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生物催化合成UMP及乳清酸磷酸核糖转移酶特性的研究

王星

   核苷酸是一类在代谢上极为重要的生化物质,除了作为DNA、RNA的前体外,在细胞的生长代谢、能量的储存和转化、免疫反应,及信号传导中,都有核苷酸的参与。嘧啶核苷酸的用途广阔,在食品制造、农业、医药生产上都有极为重要的用途。近年来随着核酸工业的发展,其作为药物中间体、保健品和食品添加剂的重要性越来越突出。此外,它还是寡聚糖合成中的必需前体,而后者因其在生化识别过程中的重要作用成为众多研究领域的热点。尿嘧啶核苷酸(UMP)是嘧啶核苷酸生物合成中处于结点位置的重要核苷酸。在寡聚糖合成和抗癌药物生产中,UMP都是重要的前体物质。其市场需求很大,蕴含有良好的商业潜力。但与此同时,由于生产困难,嘧啶核苷酸价格昂贵已成为该领域进一步发展的主要限制因素。特别是在我国,嘧啶核苷酸产品缺乏限制了糖化学和糖生物学相关领域的研究。 微生物转化合成核苷酸,就是利用微生物作为酶源,催化核苷酸的前体物质转化为核苷酸。相对于其他生产方法,该方法不但缩短了生产周期,也使核苷酸的产量大大增加;反应体系简单,后提取工艺相对更简单容易;而且,该方法可以通过偶联不同的基因工程菌株,生产多种复杂核苷酸、核苷糖乃至寡聚糖。这在核苷酸工业、医药及糖化学、糖生物学合成工业中是极其重要的一个环节,也是其他方法不能替代的一个关键环节。本工作以UMP为模式核苷酸探讨了微生物催化合成核苷酸过程中的主要影响因素,分别从转化条件和菌株(催化关键酶)的角度对核苷酸催化合成过程进行了详细的描述。 首先根据核苷酸类物质的电荷及结构差异,分别建立了薄板层析和高压液相色谱(HPLC)的检测方法来分离检测核苷酸类物质。其中,薄板层析检测法可以分离乳清酸和UMP,定性分析转化液中的底物和产物;而建立在离子对色谱技术基础上的HPLC检测方法可以同时分离多种核苷酸类物质,并可根据标准曲线对反应中的产物定量,从而为后面的工作奠定了基础。 在建立了快捷的检测方法后,采用产氨棒杆菌模式菌株Cornebacteriumammoniagenes ATCC6872,以乳清酸为底物,建立了微生物催化合成UMP的方法。整个过程分两步进行;首先将C.ammoniagenes ATCC6872在高盐培养基中培养;在菌体细胞达到最高转化能力时收集细胞,作为催化反应体系的酶源。首先考察了培养条件对UMP生产的影响,在以玉米浆作氮源,pH7.0的培养基中培养15小时(处于对数生长中期)的菌体显示出最高的转化能力,在相同的反应条件下能生产更多的UMP。确定了培养条件以后,分别通过单因子实验和统计学实验对催化反应条件进行了优化。通过单因子实验,确定了催化反应液的最优组成为乳清酸,葡萄糖,磷酸离子(等摩尔的KH_2PO_4和K_2HPO_4),MgCl_2和Triton X-100。而统计学实验中的Plackett-Burman实验进一步明确了催化反应体系中最主要的影响因素;磷酸离子和作为酶原的C.ammoniagenes细胞。在此基础上,最后通过中心组合实验得到最优的反应物配比,使UMP的产量达到32 mM(10.4g l~(-1)),是优化前产量的3倍以上。 乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRTase)催化乳清酸和5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成乳清苷酸,是嘧啶核苷酸合成中形成核苷酸的一步,也是生物催化法合成UMP的关键酶。利用巢式PCR和原位杂交的方法得到了C.ammoniagenesATCC6872中的一个623bp的DNA片断(p26)。序列分析显示该片断包含了555bp的编码OPRTase的基因pyrE和63bp的前导区。和已详细研究的Escherichiacoli和Salmonella typhimurium的OPRTase相比,其编码区编码的氨基酸序列的相似性只有28%。序列分析显示,OPRTase的大多数活性区和活性位点在克隆到的酶中都能找到,也有一些在S.typhimurium OPRTase中被认为是活性必需的位点在C.ammoniagenes的酶中被具有相似侧链或相似极性的其它氨基酸所代替。这些氨基酸被认为在催化中的作用并不会因此产生重大改变。但值得注意的是,S.typhimurium的OPRTase上的一个重要的活性位点,Lys 73,在C.ammoniagenes的OPRTase中却找不到。据报道,该位点和OPRTase的催化起始有关。该位点的缺失暗示C.ammoniagenes的OPRTase和之前报道的其它物种的OPRTase可能在性质和催化机理上有很大差异。因此,构建了pyrE基因的表达质粒,使该基因在E.coli中过量表达,并纯化了在E.coli中过量表达的C.ammoniagenes ATCC6872的OPRTase。 该酶和多数OPRTase一样,属于同源二聚体;催化的反应需要有二价金属离子的激活,Mg~(2+)是反应最适激活剂,其最适浓度为1-3 mM,Mn~(2+)和Co~(2+)也可以活化反应,而其他金属离子(Zn~(2+),Ca~(2+),Ba~(2+),Ni~(2+))都不能替代镁离子起到活化反应的作用;该OPRTase不耐热,50℃保温30 min就会造成50%的酶活损失,而最适反应温度出现在35℃;该酶催化的正反应(OMP合成反应)和逆反应(OMP焦磷酸解反应)的最适pH不同,正反应的最适pH为10.5-11.5,而逆反应的为5.5;对该酶催化的正逆反应的动力学参数也进行了研究,通过双倒数曲线得到乳清酸、PRPP、OMP和PPi的k_m值分别为33μM,64μM,45μM,和36μM。正反应的最大反应初速度(V_(max))为1,150 units mg~(-1)蛋白,逆反应的最大反应初速度(V_(max))为550 units mg~(-1)蛋白。 和其他已报道的OPRTase相比,C.ammoniagenes OPRTase的生化性质有几处明显的不同;(1)正逆反应pH不同。大多数OPRTase只检测了正反应的最适pH。(2)正反应最适pH偏高。已报道的OPRTase正反应最适pH一般在8-10,而C.ammoniagenes的OPRTase催化正反应的最适pH达到10.5-11.5;(3)OMP的K_m值偏高。比其他OPRTase报道的K_m值高了将近10倍。这些性质上的差异都指向一个催化上重要位点的缺失,Lys 73。该位点的缺失也暗示着C.ammoniagenes OPRTase的催化机理可能不同于以往的报道。 嘧啶合成基因的表达调控在多种生物中都有报道,本文也考察了C.ammoniagenes ATCC6872中编码OPRTase的pyrE基因的表达调控情况。对培养在含有尿嘧啶和不含有尿嘧啶的培养基中的原始菌株的OPRTase酶活的测定显示,尿嘧啶会抑制C.ammoniagenes ATCC6872 pyrE基因的表达。随后,带有63bp非编码前导序列的pyrE基因(p26)被克隆到一个表达载体上,并转化到E.coli宿主中。在E.coli中的实验证明p26对尿嘧啶敏感;培养在含有尿嘧啶的培养基中的p26转化子的OPRTase活力比不含尿嘧啶的培养基中低,而作为对照组的不含63 bp前导区的pyrE基因,在这两种培养基中显示了相差无几的活力。这说明在63 bp的前导区内包含了一个对尿嘧啶敏感的调控因子。 最常见的嘧啶合成基因的调控元件是衰减子。但是对p26的前导区的序列分析却显示在这63 bp前导区内,没有任何可能的衰减子结构。而随后在棒杆菌内的实验进一步表明,在C.ammoniagenes中这63 bp的前导区没有调控功能;含有p26的C.ammoniagenes转化子在尿嘧啶存在下表现出的OPRTase活力和不存在尿嘧啶时相差不大。这样的结果意味着63 bp的前导区中包含的调控因子只在E.coli中起作用,而在棒杆菌中不起作用。由于E.coli中已经发现有多种调控机制可以控制pyr基因的表达,那么,最有可能的情况或许是这63 bp中包含的E.coli的某一种调控机制在棒杆菌中是不存在的。 C.ammoniagenes是生物转化法生产嘧啶核苷酸的工业菌株,它提供了合成UMP的酶源和一个重要底物PRPP,是UMP合成的关键。OPRTase催化UMP催化合成中的第一步反应,它的表达受到体内核苷酸的反馈抑制。当UMP浓度过高时,会抑制该酶的表达,限制了UMP的产量。为了提高UMP产量,我们克隆了C.ammoniagenes ATCC6872的一个组成型启动子,IJ59,并将它与p26连接,构建了无需诱导即可过量表达合成中关键酶(OPRTase)的穿梭质粒pXMJIE。在E.coli中的实验表明该质粒在非诱导状态下培养12小时,其OPRTase活力能达到对照菌株的5倍以上。虽然由于研究时间有限,该表达质粒在C.ammoniagenes中表达的实验,现在还在进行当中,但根据Paik和Lee的报道,IJ59启动子在棒杆菌中的表达比在E.coli中还要略高,因此有理由相信,该质粒在C.ammoniagenes中一样可以得到高表达的OPRTase。通过构建能高效表达UMP合成中关键酶的C.ammoniagenes菌株,希望可以达到提高UMP产量的最终目的。……   
[关键词]:尿嘧啶核苷酸;产氨棒杆菌;乳清酸磷酸核糖转移酶;生物催化
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东大学2007年
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