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猪流行性腹泻病毒S蛋白不同基因片段重组腺病毒的构建与小鼠免疫特性研究

韦显凯

   猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪腹泻和死亡的重要病原之一。目前,虽然商品化PEDV疫苗已普遍使用,但该病在我国仍有流行,并引起严重的经济损失。因此,研制一种新的有效的PEDV疫苗十分必要。 S蛋白是在PEDV的重要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体,是研究PEDV基因工程疫苗的主要目的基因。本研究利用RT-PCR技术把S基因的三个片段S_(498-638)、S_(1-638)和S_(639-1384)分别克隆入腺病毒表达载体系统中,成功构建了三个重组腺病毒rAd-S_(498-638)、rAd-S_(1-638)和rAd-S_(639-1384),并在小白鼠体内进行免疫特性研究,为研究PEDV重组腺病毒疫苗奠定基础。 本研究根据GenBank数据库中的PEDV基因序列(No.AY653204)设计了四条引物P1、P2、P3、P4,其中P1和P3分别含有KpnⅠ酶切位点和起始密码子ATG,P2和P4分别含有XhoⅠ酶切位点和终止密码子TAA、TGA。其中引物P1和P2用于扩增S蛋白核心抗原基因第498-638位的氨基酸的基因片段S_(498-638),P3和P2用于扩增S蛋白的第1-638位氨基酸的基因片段S_(1-638),P1和P4用于扩增S蛋白第639-1384位氨基酸的基因片段S_(639-1384),通过RT-PCR技术从国内分离的PEDV JS株中分别扩增获得大小为426bp,1917bp,2661bp的PCR产物,经纯化后与穿梭载体pShuttle-CMV同时进行双酶切,分别经回收后连接。连接产物转化DH5a,然后在卡那霉素抗性(Kan~r)平板上挑取阳性菌落,37℃过夜培养。提取质粒经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,结果所克隆的片段与预期片段大小相符;DNA测序分析结果表明,所插入的基因片段阅读框完全正确,3个基因片段基因序列和PEDV JS株的S基因片段的对应序列的同源性分别为98.6%,97.4%,98.4%。将鉴定正确的重组质粒pShuttle-CMV-S_(498-638)、pShuttle-CMV-S_(1-638)和pShuttle-CMV-S_(639-1384)分别用PmeⅠ进行线性化,然后电转化进含有骨架载体pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞中,经过同源重组,在具有卡那霉素的LB平板上筛选阳性菌落,然后利用PacⅠ对重组质粒进行酶切鉴定,结果与预计的相符,阳性重组质粒分别命名为pAd-S_(498-638),pAd-S_(1-638),pAd-S_(639-1384);经鉴定后,将三个重组质粒大量提取,PacⅠ酶切线性化,阳离子脂质体法转染到HEK293A细胞,于37℃培养7天后出现细胞病变,收获病毒。经噬斑纯化,用间接免疫荧光试验(IFA)鉴定三个重组腺病毒S基因片段的表达,结果表明重组腺病毒中的三个蛋白基因能够在HEK293A细胞中转录和表达,分别命名为rAd-S_(498-638),rAd-S_(1-638),rAd-S_(639-1384)。将重组病毒在293细胞上连续传代至20代,每传5代测定病毒滴度一次,其滴度稳定TCID_(50)分别为10~(-6.29)/ml、10~(-5.75)/ml、10~(-6.5)/ml。 将100只18-20g的雌性小白鼠随机分为5组,每组20只。第1、2和3组分别免疫三个重组腺病毒rAd-S_(498-638),rAd-S_(1-638)和rAd-S_(639-1384),第4、5分别免疫野生型腺病毒(wtAd)和PBS以作为阴性对照和空白对照。通过皮下注射途径分别进行免疫。首免后间隔14d加强免疫一次,共免疫两次。分别于首次免疫后14、28、42、56d,每组随机取出5只小鼠采血测定ELISA抗体,并取小鼠脾通过MTT法进行淋巴细胞转化试验。首免后42d的小鼠血清每组取3份测定中和抗体。结果显示:在三个免疫组的小白鼠血清均能够检测到一定水平的EHSA特异性IgG和病毒特异性中和抗体,且在二免后28天(即首免后42天)其OD_(450)值均能达到一个最高值,其中rAd-S_(498-638)所产生的EHSA抗体和中和抗体均最高,另外两组则较低。但这三个重组腺病毒均不能使免疫小鼠的淋巴细胞转化值增高。 综上所述,本研究成功构建了3株重组腺病毒,能够稳定表达PEDV S蛋白的三个片段,TCID_(50)分别为10~(-6.29)/ml、10~(-5.75)/ml、10~(-6.5)/ml。小白鼠免疫试验证实,三个重组腺病毒均具有PEDV免疫原性。从而为PEDV基因工程疫苗的研究奠定了重要基础。……   
[关键词]:PEDV;S蛋白;重组腺病毒;免疫
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2007年