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弓形虫感染对雄性生殖损害的实验研究

周永华

   弓形虫病是一种世界范围内广泛存在的人兽共患性疾病,是猪、羊等经济动物感染性繁殖障碍的重要原因,同时也是人类生殖健康损害的感染性因素之一。弓形虫作为专性细胞内寄生的重要机会性致病原虫,进入宿主机体后,能引起包括生殖系统在内的多脏器损害。弓形虫可侵入雄性生殖系统,如睾丸、前列腺、附睾等,引起弓形虫性睾丸炎或雄(男)性不育。实验动物小鼠对弓形虫感染高度易感,常用于建立急性弓形虫病研究的动物模型;实验动物大鼠对弓形虫感染则与人类、猪、羊等的感染相类似,呈现一种亚临床感染经过,因此常用于人类弓形虫病亚临床感染的比较研究。本研究目的是将清洁级雄性实验动物小鼠和大鼠为研究对象,建立弓形虫感染的雄性动物模型;同时将纯化的弓形虫速殖子与正常生育男性精子一起孵育,建立弓形虫人工感染精子的实体模型;以此研究弓形虫感染对雄性生殖的损害作用与一些可能的作用机制,同时探讨阿奇霉素对大鼠雄性生殖损害的药物控制效果。主要研究内容包括: 一、弓形虫感染对清洁级实验动物小鼠和大鼠的雄性生殖损害 1、弓形虫感染对小鼠雄性生殖机能的影响 将1×10~3/mL弓形虫(RH株)速殖子悬液0.3mL腹腔接种清洁级NIH小鼠,感染4天后,将感染小鼠睾丸制成直接印片及病理切片,观察小鼠睾丸的病理学变化及弓形虫侵入生精细胞情况,并对弓形虫感染小鼠的睾丸乳酸脱氢酶—同工酶、精子密度、精子活力、精子畸形数,以及与正常雌鼠交配后雌鼠的怀孕活胎数进行检测。结果显示:弓形虫急性感染小鼠睾丸直接印片中可见生精细胞胞质及核内弓形虫速殖子,睾丸切片病理学改变为生精停滞,精原细胞胞质空泡性变。弓形虫急性感染小鼠的睾丸乳酸脱氢酶—同工酶活性、精子密度、精子活力、以及与正常雌鼠交配后雌鼠怀孕活胎数,均比正常对照低,但精子畸形数则显著升高(P<0.05)。提示:弓形虫感染对雄性小鼠的生殖机能有明显的影响。 2、弓形虫感染对大鼠的雄性生殖损害 将2×10~5/mL速殖子腹腔接种成年雄性SD清洁级大鼠,感染9周后,对大鼠血清性激素、精子数、精子活率、活力、精子质量、睾丸酶活性及睾丸组织的病理学进行检测。同时将雄性弓形虫感染大鼠与正常雌性成年SD大鼠按1:2合笼交配1周,于妊娠第21天解剖雌性大鼠,检查雌鼠的黄体数、胎鼠的性别、体重、身长和尾长等。结果表明:弓形虫感染9周,大鼠的睾丸和附睾的相对重量有所下降,精子数、活力、活率降低,血清性激素睾酮水平下降,睾丸组织呈明显的形态学变化。与弓形虫感染雄性大鼠成功交配的雌性大鼠的受孕率和产仔数均显著减少,但胎鼠的平均体重、身长、尾长和胎鼠的性别比例与对照组比较无显著性差异。提示:弓形虫感染对大鼠雄性生埴系统和雄性生育功能均有一定程度的损害。 3、弓形虫速殖子体外对人类精子运动功能的影响 将经CF-11纯化的活弓形虫(RH株)速殖子悬液,对10例健康生育男性手淫获得、并经上游优化处理的精子进行体外感染孵育。按弓形虫速殖子的虫体含量分成A组(1×10~3/mL)、B组(1×10~4/mL)、C组(1×10~5/mL)、D组(1×10~6/mL)、E组(1×10~7/mL)、F组(空白对照组),分别孵育,并于0、1、2、4h后取样,应用计算机辅助精子分析系统(CASA),分别检测其精子运动的直线速度、曲线速度、平均路径速度、头部侧摆幅度、前向性运动百分率等参数,观察精子存活率,精子形态及凝集情况。另将1×10~5/mL纯化的活弓形虫速殖子悬液,在体外与15例经上游优化处理的生育男性精子一起孵育0、2、4、8、16、24 h后,检测其精子运动方式参数。结果显示:弓形虫速殖子与精子体外孵育后,其精子运动速度和前向运动百分率等随虫体含量增加及孵育时间的延长而下降,其他参数与对照组相比也相继出现显著性差异。1×10~5/mL弓形虫速殖子在体外与精子孵育8h后,精子运动速度显著下降。孵育8h、16h后的精子运动方式为原地转圈和锯齿形运动,孵育24h后,精子的运动速度小于10μm/s,有活力精子则全是原地转圈运动。并观察到精子凝集和虫体黏附现象。提示:弓形虫速殖子体外可显著降低精子存活率和抑制精子运动功能,弓形虫速殖子对精子运动速度和运动方式有明显影响。其机制可能与弓形虫速殖子对人类精子的黏附作用和虫体侵入精子形成精子损伤等有关。 二、弓形虫感染对小鼠和大鼠雄性生殖损害作用的可能机制研究 1、弓形虫感染对小鼠睾丸组织细胞周期和生精细胞凋亡的影响 应用流式细胞术检测弓形虫(RH株)感染10~3/mL、10~4/mL、10~6/mL3个剂量组小鼠睾丸组织细胞周期,并设生理盐水和环磷酰胺对照组。应用瑞-姬染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧核苷酸原位末端标记法对弓形虫腹腔感染0.2mL×10~5/mL小鼠的睾丸生精细胞凋亡率进行检测。结果显示:不同剂量的弓形虫感染均可使小鼠睾丸组织细胞各时相的细胞百分数发生变化,并随着剂量的增加,G_0/G_1、S时相的细胞百分数明显减少,与阴性对照组比较差异具有显著性(P<0.05)。G_2/M时相的细胞百分数逐渐增多,各剂量组与阴性对照组比较差异具有显著性(P<0.05)。弓形虫腹腔感染小鼠的睾丸生精细胞凋亡率显著高于正常。提示:弓形虫感染可能抑制小鼠睾丸细胞的DNA合成,可引起G_2期细胞阻滞,从而使细胞的有丝分裂延伸。并且弓形虫感染可能有促进小鼠生精细胞凋亡的作用。 2、弓形虫感染对大鼠T细胞免疫功能的动态研究 应用流式细胞术分别检测腹腔感染经CF-11纤维素纯化的活弓形虫(RH株)速殖子2×10~5/mL悬液2mL后第3、7、14、21、28、35、42、60d大鼠外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的百分率,并应用酶联免疫吸附试验测定其外周血IFN-γ、TNF-α、IL-4等细胞因子水平。结果表明:CD8~+T细胞亚群水平在感染弓形虫后3d、7d、14d、21d时均显著低于正常水平(P<0.05),至感染后28d恢复至正常。而CD4~+T细胞亚群水平在整个感染过程中则无显著性变化。CD4~+/CD8~+比值升高,以感染后第14d最为明显;大鼠外周血中IFN-γ和IL-4水平在感染后7d开始升高(P<0.05),至感染后60d时仍高于正常水平,TNF-α至感染后28d时方高于正常(P<0.05),至感染后60d时也仍高于正常水平。结果提示:大鼠感染弓形虫初期(急性期)可引起其T细胞亚群的分布失衡,但随着感染时间的延长而得到修复。 3、弓形虫感染对大鼠睾丸组织细胞凋亡的影响 腹腔感染2×10~5/mL活的纯化弓形虫速殖子悬液(CF-11纤维素纯化)2mL于SD大鼠,建立大鼠弓形虫病模型。9周后解剖大鼠,取睾丸制成睾丸组织单细胞悬液,应用流式细胞术检测其细胞凋亡和细胞周期。结果表明:弓形虫感染大鼠睾丸组织细胞凋亡率显著高于正常对照组(P<0.05)。提示:弓形虫感染可引起大鼠睾丸组织细胞发生凋亡。 三、弓形虫感染对大鼠雄性生殖损害的药物控制研究 通过对腹腔感染弓形虫的雄性实验动物大鼠模型进行药物治疗实验,开展了阿奇霉素对弓形虫感染大鼠雄性生殖系统和雄性生育力的保护作用研究,并从睾丸细胞凋亡和细胞周期及外周血NO、T细胞亚群和IFN-γ、IL-4、TNF-α细胞因子水平等方面对阿奇霉素抗弓形虫的作用机制进行了探索性研究。研究结果提示:阿奇霉素可有效地治疗弓形虫感染对大鼠的雄性生殖损害。……   
[关键词]:弓形虫;感染;雄性;生殖损害
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2006年