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麦冬凝集素与蜘蛛抱蛋凝集素的基因克隆及序列分析

刘金枝

   麦冬凝集素(Ophiopogon japonicus Lectin,OJL)是来源于百合科的具有多重生物学活性的甘露糖结合蛋白,属于单子叶甘露糖结合凝集素。蜘蛛抱蛋凝集素也是具有多种生物学活性的甘露糖结合蛋白,在抗虫抗肿瘤方面显示了良好的活性,具有广阔的运用前景。这类凝集素由于具有独特的糖结合特异性、逆转录病毒抑制活性和保护农作物免受昆虫和线虫攻击而引起人们浓厚的兴趣。本文采用同源克隆的方法,通过对麦冬与蜘蛛抱蛋球茎RNA的提取,反转录成cDNA,从Genbank上比较已登录的百合科凝集素的序列,找出其保守序列,并结合软件设计了简并引物,进行3’RACE末端快速扩增,得到了3’端的部分序列,然后根据已得到的序列设计特异性引物,应用在cDNA的3’端随机添加若干PolyA的方法,在cDNA模板3’端加上PolyA,再以此为模板进行PCR,从而克隆得到了麦冬凝集素5’端的部分序列。将3’与5’序列合并,就能获得其cDNA全长序列。 以获得的全长cDNA序列和推导出的氨基酸序列与百合科其他植物凝集素在Genbank中的Blast上进行比较,可知麦冬凝集素的全长cDNA序列由704个核苷酸组成,开放阅读框长513bp,编码170个氨基酸,起始密码子位于第46~48bp,终止密码子位于在556~558bp处,在起始密码子上游有一个由45个碱基组成的5’非编码区;在终止密码子下游有一个由146个碱基组成的3’非编码区,包括两个加poly(A)信号和一段真核生物mRNA所特有的poly(A)序列。通过序列的测定,发现OJL基因均编码前体蛋白:含有信号肽序列、成熟蛋白序列和C-末端剪切序列。该成熟蛋白由109个氨基酸组成,分子量为12.1KD。成熟蛋白在氨基酸水平上与雪花莲凝集素同源性达70.4%,与囊丝黄精凝集素同源性为81.1%,与多花黄精凝集素同源性为83.5%与蜘蛛抱蛋凝集素第一个亚基的同源性为66.4%,与蜘蛛抱蛋凝集素第二个亚基的同源性为73.2%。在blocks数据库(www.blocks.fhcrc.org)中检索OJL蛋白氨基酸序列的结构域,发现OJL氨基酸序列中存在一个凝集素功能结构域区,并具有2个典型的甘露糖专一结合位点盒(QDNY)。成熟蛋白氨基酸中极性氨基酸占44.04%,疏水性氨基酸占30.28%,酸性氨基酸占7.34%,碱性氨基酸占2.75%。OJL的信号肽包括27个氨基酸。此基因的克隆,为深入研究OJL结构基因,剪切机制,表达和调控机制以及OJL结构和功能的关系奠定了重要的基础。 研究发现蜘蛛抱蛋凝集素cDNA全长1162bp,开放阅读框长930bp,编码309个氨基酸的前体蛋白,起始密码子位于38~40bp,终止密码子位于在965~967bp处,在起始密码子上游有1个由37个碱基组成的5’非编码区;在终止密码子下游有1个由195个碱基组成的3’非编码区,其后面还有一段真核生物mRNA所特有的poly(A)序列。通过序列的分析可以发现该蛋白含有2个结构域,即其前体蛋白含有:信号肽序列、亚基1、连接肽、亚基2和C—末端剪切序列。蛋白亚基1和2分别由106和108个氨基酸组成,分子量为12KD左右,等电点分别为5和7.13。在整个氨基酸的组成中,亚基1的氨基酸中极性氨基酸占33.64%,疏水性氨基酸占32.76%,酸性氨基酸占10.91%,碱性氨基酸占8.81%;在亚基2中极性氨基酸占34.82%,疏水性氨基酸占35.71%,酸性氨基酸占7.14%,而碱性氨基酸同样占6.25%。AEL与百合科其它凝集素的同源性较高,第一个亚基所编码的氨基酸序列与雪花莲凝集素同源性达51.8%,与囊丝黄精凝集素同源性为60.4%,多花黄精凝集素65.5%与铃兰凝集素第一个结构域同源性为50.0%,与铃兰凝集素第二个结构域同源性为49.1%。第二个亚基的数字分别为61.6%、74.3%、77.7%、57.8%、55.7%。在大多数百合科凝集素中,通常都具有三个甘露糖结合位点盒,通过对AEL的分析发现它比较特殊,AEL-subunit1有两个甘露糖结合位点,一个已经发生突变;AEL-subunit2:只有一个甘露糖,其中有两个已经发生突变。二级和三级结构分析发现他与GNA的结构非常相似。密码子的偏爱性分析发现AEL中不存在稀有密码子,可直接用于大肠杆菌的表达。因此,该基因的克隆为深入研究AEL结构基因、剪切机制、表达和调控机制以及其结构与功能的关系奠定了重要的基础。……   
[关键词]:麦冬凝集素;蜘蛛抱蛋凝集素;简并引物;RACE;基因克隆;同源分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川大学2007年