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靶向MDR1基因RNAi腺病毒载体的构建及肝癌细胞转染研究

张志云

   目的:构建针对MDR1的RNAi腺病毒载体,转染肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM,研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的影响,以及对P-糖蛋白(P-gp)表达和功能的抑制作用。 方法:1.通过分析PGE-1和pshMDR1基因序列,找到包含U6启动子和shRNA序列的完整shRNA表达单元,并且包含两个酶切位点XhoI和XbaI,与pshuttle的MCS的酶切位点吻合。利用XhoI和XbaI双酶切将shRNA表达单元构建到pshuttle,命名为pshuttleMDR1。2.将我们构建的pshRNA-MDR1经PmeI酶切成线形质粒,再进行去磷酸化以防止其自身环化,与腺病毒骨架质粒PAdeasy共同转化含重组酶的BJ5183菌株内完成重组腺病毒质粒PAd- MDR11。3.质粒PAd- MDR11经PacI酶切后产物加入到AD293细胞培养后完成病毒颗粒包装。4.将病毒感染肝癌耐药细胞株SMMC-7721/R流式细胞仪检测细胞膜表面P-gp表达和细胞内Rhdaming123(Rh123)的储留(P-gp功能试验),激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内Rh123的分布,Western Blot检测P-gp含量。结果: 1.重组构建的pshRNA-MDR1及Padeasy- shMDR1载体经过PCR扩增后电泳分析均显示在相对分子质量600bp左右处有一条明亮的条带,符合阳性克隆的特性。 2.罗丹明123与细胞共培养30后经流式细胞仪检测结果提示, PAd- MDR11和PAd- MDR13转染的细胞平均荧光强度显著高于SMMC-7721/R细胞系细胞,阳性率为分别91.5%、90.8%,后者阳性率为29.7%,差异显著(p<0.05)。3.用间接免疫荧光法检测细胞膜表面P-gp,经流式细胞仪检测可见各组细胞的阳性率分别是: SMMC-7721/S, 26.3%; SMMC-7721/R,85.3%; SMMC-7721/R+ PAd-MDR11 22.9%; SMMC-7721/R+ PAd-MDR13 30.8%; SMMC-7721/R+PGE-1 , 85.8%。 4. Western Blot检测P-gp蛋白表达的变化:经病毒感染的SMMC-7721/R在170Kd处的显色明显低于对照SMMC-7721/R,而与SMMC-7721/S细胞接近。 结论:成功地构建了靶向MDR1基因的RNAi腺病毒载体pAD-MDR11,并能有效降低肝癌耐药细胞MDR1 mRNA的表达。……   
[关键词]:RNAi;肝癌细胞;多药耐药基因;腺病毒载体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中科技大学2006年