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肝细胞中结合丙型肝炎病毒C区RNA的特异性蛋白分子筛选、鉴定和表达研究

苏海霞

   目的和意义 丙型肝炎病毒(HCV)是慢性肝炎和肝癌的主要病原体之一,但对于HCV的复制和致病机制目前还是不甚清楚。宿主细胞中的许多蛋白分子可以通过与HCV RNA基因组的相互作用,调节HCV的翻译、复制和病毒的组装。现有研究发现的HCV RNA结合蛋白,其结合区域主要位于HCV RNA的5’-UTR、3’-UTR和RNA的副链。但是与HCV CORE区(核心区)RNA结合的细胞蛋白却很少有研究报导。本研究拟采用凝胶迁移和紫外交联的实验方法,从人肝癌细胞系HepG2细胞中初步筛选与HCV CORE区RNA结合的细胞蛋白分子,确定其与HCV RNA结合的具体区域,并对RNA结合蛋白进行分离、鉴定。通过研究宿主细胞蛋白与HCV C区RNA的相互作用,将有助于我们对宿主和病毒相互作用的更好理解,从而在细胞蛋白质水平对病毒RNA的翻译、复制和病毒蛋白表达进行调控;并有利于在丙型肝炎的预防和治疗方面提出针对性的措施。 方法 ①采用RT-PCR扩增HCV C区cDNA序列,并构建重组质粒pGEM-HCV;以pGEM-HCV为模板,采用体外转录的方法制备DIG标记和未标记的HCV C-RNA分子;将DIG标记的HCV C-RNA与HepG2细胞蛋白结合,进行凝胶迁移实验;将DIG标记的HCV C-RNA与HepG2细胞蛋白结合,进行紫外交联筛选实验,并采用未标记的HCV C-RNA分子进行竞争性实验;电泳后将RNA/蛋白转移至NC膜,以DIG抗体检测NC膜上的DIG信号,判断是否有细胞蛋白与HCV C-RNA结合。 ②采用PCR、克隆和体外转录的方法,制备不同长度的HCV C-RNA分子;分别将不同长度的HCV C-RNA分子与细胞蛋白进行结合反应和紫外交联实验,确定HCV C-RNA与细胞蛋白的结合区域;采用抗-DIG和免疫沉淀方法,从RNA和蛋白混合物中,分离与DIG标记的HCV C-RNA分子结合的细胞蛋白;通过SDS-PAGE和NC膜的检测结果的比对,切取目的蛋白条带,进行肽指纹图谱分析鉴定。 ③提取HepG2细胞总RNA,以RT-PCR方法扩增PGAM-B的全基因片断,与载体pcDNA~(TM)3.1/V5-HisA连接,构建真核表达质粒pcDNA-PGAM;以PCR方法扩增pGEM-HCV中HCV核心蛋白基因片断,与载体pcDNA3.0连接,构建真核表达质粒pcDNA-HCV;经酶切和测序鉴定后,将真核表达质粒分别转染HepG2细胞;以免疫细胞化学的方法,在细胞爬片上分别检测细胞中PGAM-His蛋白和HCV核心蛋白的瞬时表达情况。结果 ①从1例HCV感染者血清中扩增得到的503bp HCV cDNA序列,构建了重组质粒pGEM-HCV,并进行了PCR、酶切鉴定和测序鉴定。②所得HCV cDNA序列与已知HCV序列(AB092962.1)比较,属于HCV 1型基因C区,仅有两个核苷酸不同,nt 67(23aaK→E)和nt 177(沉默突变),其余序列均一致。③通过凝胶迁移实验初步检测到,有HepG2细胞蛋白与HCV C-RNA分子结合。④通过紫外交联实验检测到,有多个HepG2细胞蛋白与HCVC-RNA分子在体外发生了结合;随着结合反应体系中细胞蛋白浓度的增加,HCV C-RNA和蛋白的结合量随之增多;未标记HCV C-RNA对DIG标记的HCV C-RNA与HepG2细胞蛋白的结合有竞争性抑制作用。⑤3个不同长度的HCV C-RNA分子(198nt、306nt和503nt)都可与HepG2细胞蛋白在体外发生结合;其中C-RNA 5’端的C198 RNA与细胞蛋白的结合条带,最为清晰和锐利。⑥经免疫沉淀后的蛋白,在NC膜上可以检测到4条明显的兰紫色RNA结合蛋白带;其中以P30蛋白条带最为清晰,蛋白量最多。⑦从SDS-PAGE胶上切取了P30蛋白条带,经肽指纹图谱分析鉴定,P30蛋白为磷酸甘油酸变位酶1(PGAM-B)。⑧从HepG2细胞中,扩增得到了约为760bp的PGAM-B的cDNA全基因片断;所得PGAM-B基因序列与已知PGAM-B基因序列(J04173)进行比较,完全一致。⑨基因序列和蛋白读码框均正确的真核表达质粒pcDNA-PGAM和pcDNA-HCV,分别转染HepG2细胞后,可在细胞爬片上检测到PGAM-His和HCV核心蛋白的瞬时表达。 结论 ①在HepG2细胞中,有多个细胞蛋白分子可以与HCV核心区RNA在体外发生特异性的结合。②HCV C-RNA与HepG2细胞蛋白的结合区域可能位于HCV C区RNA的5’端。③PGAM-B可以与HCV C-RNA在体外发生特异结合,提示PGAM-B可能通过与HCV核心区RNA的相互作用,参与HCV RNA的翻译和复制。④PGAM-B和HCV核心蛋白可以在HepG2细胞中瞬时表达。……   
[关键词]:丙型肝炎病毒;RNA结合蛋白;核心区RNA;紫外交联
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第四军医大学2007年