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脊灰病毒Sabin1株疫苗载体构建及在流感通用型疫苗研制中的初步应用

李长贵

   流感病毒RNA聚合酶缺少校正功能,导致基因组在复制过程中容易发生突变,人群中因以往感染产生的抗体不能有效地防止新毒株感染,因而每年需要注射流感疫苗,给社会带来沉重的经济负担。如果有一种通用型疫苗,经过全程免疫后,产生广谱性抗体,则能够预防各种变异病毒,或降低感染病毒后疾病的严重程度。甲型流感病毒囊膜上除血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)外,还含有一个分子量较小的基质蛋白M2,其胞外区(M2e)非常保守,是研制通用型疫苗的最佳靶位。由于M2e只含有24个氨基酸,需要以各种措施来增强其免疫原性。本论文拟将口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)Sabin1株病毒改造为疫苗载体,采用多聚蛋白融合策略,插入流感M2e基因,将前者作为表达载体和免疫佐剂,提高人体针对M2e的免疫应答,构建一种能抵御各种甲型流感病毒的通用型疫苗。 通过RT-PCR方法扩增了Sabin1株病毒基因组的三个片段f1、f2、f3并分别克隆,在f1和f2、f2和f3片段之间含重叠序列,内有基因组唯一的酶切位点。因此,三片段可以通过酶切和连接获得全基因组。将三个克隆分别测序,与GenBank中序列比较,发现在基因组7440bp中只有三个位点不同,其中26 A→G,355 C→T两个位点处于非编码区,6735 A→G导致聚合酶3D上250位氨基酸由赖氨酸变为精氨酸。说明Sabin1株基因组比较稳定,适合于作为疫苗载体。 基因组起始密码子(nt743)位于pGEM-f1质粒上,通过重叠PCR方法在之前插入多克隆位点(EcoRI、XmaI、XhoI)和人工蛋白酶切位点(ALFQG)构成的功能盒(Cassette),形成pGEM-f1m质粒;同样,在位于pGEM-f2质粒上P1/P2结合处引入类似序列,构建为pGEM-f2m质粒。连接为基因组后可形成两种基本型载体PV1和PV2。多克隆位点内插入的外源基因随多聚蛋白表达后,在病毒编码的蛋白酶切割后释放外源蛋白。 为提高载体RNA的转染效果,另外在载体上进行两项改造:基因组前加入锤头型核酶(Rz)基序,合成RNA后发挥核酶功能,去除多余核苷酸,产生PV基因组真正的5’-末端;在基因组后导入poly(A)40结构,后者是PV RNA感染的必要基序。两个基序均以PCR引物延伸方法产生,并通过基因置换方式导入到pGEM-f1m和pGEM-f3中,经测序证明引入的基序与设计序列一致。将改造前和改造后的质粒进行三片段连接,形成八种载体,分别含有不同的功能盒及基序组合。 将携带各种PV载体的质粒线性化后,以T7 RNA聚合酶体外转录法合成RNA并纯化,通过电泳发现RNA完整性、均一性良好,适合于转染细胞。对含有Rz序列的RNA进行体外切割,经PAGE电泳检测反应进程,确定在合适的缓冲液中作用1.5小时获得最佳切割效果。 采用电穿孔、脂质体转染法和磷酸钙转染法将提取的PV Sabin1 RNA转染入Vero细胞,以形成的噬斑数目比较转染效率,筛选转染大分子RNA的最佳方法。实验结果证明脂质体Tfx-20的转染效率最佳,达到1.1~1.5×103感染性克隆/μg RNA,对细胞毒性不明显。以Tfx-20转染八种载体RNA,只有同时含有poly(A) 40和Rz基序的载体pPV1RzA和pPV2RzA能有效产生活病毒,约500~800克隆/μg RNA。感染性病毒产生时间与转染RNA量有关,当以10μgRNA转染时,60小时就可以观察到细胞病变;而以1μgRNA转染时,需要4天产生病变效应。只含有poly(A)40基序的载体RNA也可以成功转染,但效率低,当RNA量为1μg时无法得到活病毒。不含两个基序或只含Rz基序的RNA在Vero细胞上无感染性,即使将RNA量增加到30μg,培养10天亦无活病毒产生。 从霍乱弧菌中扩增霍乱毒素B亚单位(CTB)基因,测序证明正确后,以PCR引物延伸法构建CTB和M2e的融合基因,并在两端分别添加EcoRI和XhoI位点,通过双酶切将融合基因导入到pPV1RzA中,保持正常的编码框架,以建立的方法转染Vero细胞,获得了重组病毒rPV-CTBM2e。另外,扩增SARS-冠状病毒S蛋白的受体结合区基因S-RBD后,以同样方法获得了重组病毒rPV-S-RBD。提取重组病毒RNA,以RT-PCR方法扩增涵盖插入序列的片段并测序,证明两个重组病毒均携带预期片段。 将重组病毒传代多次,通过RT-PCR方法考察重组病毒的稳定性。rPV-CTBM2e病毒传代12次后仍保持完整的外源基因,而rPV-S-RBD病毒在传代过程中丢失外源基因。rPV-CTBM2e病毒一步生长曲线证明其繁殖有延迟现象,但最终能得到和Sabin1病毒同样的滴度。 将M2e合成多肽和KLH载体蛋白偶联后免疫Balb/c小鼠,制备了针对M2e多肽的单克隆抗体,以ELISA方法筛选得到7株有活性的单抗。以单抗上清检测感染Vero细胞的流感病毒,发现其中5株能与细胞表面的天然M2e结合,其中两株为强阳性,可用于重组病毒M2e表达的检测。 将重组病毒感染Vero细胞,通过免疫荧光方法,分别以抗M2e单抗和抗SARS-病毒免疫血清检测,发现在细胞中出现明显的荧光信号,并集中在细胞质中,说明外源蛋白在细胞质中成功表达,与预期结果一致。本研究为研制流感通用型疫苗和SARS-CoV疫苗奠定了基础。……