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ATP结合盒转运子A1(ABCA1)对炎症因子的调节机制及其临床意义

郭志刚

   【研究背景】 关于动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的研究已有超过100年的历史,早在1914年Antischkow首次提出胆固醇和富含胆固醇的泡沫细胞与AS的发生有关,目前AS是导致心肌梗死和脑梗死的主要病因,在有些国家和地区,由冠状动脉粥样硬化引起的心脏病已成为首位的死亡原因,冠心病(CAD)等心血管疾病严重危害人类健康,而AS是其主要病理基础,已有许多证据支持AS是一种炎症性疾病,氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)可引起血管巨噬细胞炎症反应增强,导致AS。 现在认为在AS的起始阶段,Ox-LDL的细胞毒性和自由基的作用可损伤血管内皮细胞功能,促使其分泌细胞粘附分子和化学趋向因子。血管内皮细胞分泌的细胞间黏附分子—1(ICAM-1)可介导血液中的单核细胞黏附到激活的血管内皮细胞,损伤的血管内皮细胞还可分泌单核细胞趋向蛋白—1(MCP-1),促使黏附的单核细胞进入血管壁并分化为巨噬细胞并分泌炎性细胞因子,包括白介素—1β(IL-1β)、ICAM-1、MCP-1等,增加炎症细胞浸润,引起脂质在血管壁沉着,形成泡沫细胞及AS斑块,造成AS。流行病学和临床研究表明,血浆中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与冠心病的发生率水平呈正相关,而一级预防资料也显示,LDL-C下降1%,患冠心病的危险性降低2%。 他汀降脂药的应用使我们有了降低LDL-C的有效方法,但目前的降脂治疗只能减少1/3的心脏事件,如何进一步降低冠心病的发生及心脏事件?美国Framingham Heart Study等研究显示:高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平与冠心病的发生率呈负相关,因此如何升高HDL-C的已成为人们关注的一个热点。 HDL具有多种抗AS功能,包括对低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制、改善内皮细胞功能失调、抗炎、抗血栓及促纤溶等,但是HDL主要通过参与体内逆胆固醇转运(RCT)行使其抗AS功能,RCT指的是将外周组织(包括动脉壁)游离胆固醇通过血浆脂蛋白转运至肝脏,并通过肝脏排泄的过程,它包括两个过程:(1)清除外周细胞中游离胆固醇;(2)将HDL中的游离胆固醇转运至肝脏。 ABCA1(ATP-Binding Cassette Transporter A1)是新近确定的HDL受体,1999年发现ABCA1基因是主动转运细胞内胆固醇至细胞外的基因。正常外周细胞膜上的ABCA1转运细胞内的游离胆固醇、磷脂至细胞外并与apo A-I结合,形成扁平HDL,后者再接受游离胆固醇和磷脂形成成熟HDL,由此启动RCT过程。 人ABCA1完整基因的长度为149kb,含有50个外显子,cDNA包含6783个碱基。它可编码一个估计分子量为254 kDa的有2261个氨基酸的蛋白质,其蛋白质具有下列特征:有两个保守的Walker A和B核苷酸结合区及两个跨膜区。每一个跨膜区包括6个跨膜螺旋,ABCA1的特殊性是由跨膜区所决定的,而转运活性所需要的能量是由核苷酸结合区的ATP释放所提供的。人ABCA1 mRNA在胎盘、肝脏、肺、肾上腺及胎儿组织中有最高的表达,在肾脏、胰腺、脑垂体、乳腺及骨髓中表达量最低。细胞学研究证明外周细胞,包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、单核/巨噬细胞等均存在ABCA1。 ABCA1基因功能的确定起始于Tangier病的研究,Tangier病为一种罕见的常染色体显性遗传性疾病,可表现为肿大的金黄色扁桃体、肝脾肿大、血浆HDL-C及载脂蛋白A-I(apoA-I)极度减少等变化。Tangier病人由于ABCA1功能缺陷,不能转运细胞内游离胆固醇至细胞外与apoA-I结合形成扁平的HDL,游离的apo A-I很快从血浆中清除,使血浆中apo A-I和HDL明显减少,Tangier病人存在明显的逆胆固醇转运障碍及低HDL-C血症。 现已知多个因素可以调节ABCA1的活性,ABCA1属环磷酸腺苷(cAMP)诱导的载脂蛋白受体基因,cAMP及其类似物8—溴—cAMP(8-Br-cAMP)可平行增加其mRNA、蛋白质表达及胆固醇外流率。胆固醇、乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)、Ox-LDL可增加ABCA1 mRNA及其蛋白质的表达,而HDL、apoA-I则可抑制ABCA1 mRNA及蛋白质的表达。胆固醇和cAMP对ABCA1的诱导具有单独与协同作用的机制。 在正常细胞,ABCA1是载脂蛋白介导的脂质逆转运通路中的限速蛋白质,它不仅影响血浆HDL-C水平及逆胆固醇转运,还与AS有密切关系,利用原位杂交方法观察正常人、AS病人的动脉组织,发现AS区域ABCA1基因表达上调。巨噬细胞来源的泡沫细胞中,ABCA1 mRNA是正常巨噬细胞的三倍。还有研究表明ABCA1在巨噬细胞清除过多的胆固醇,阻止AS进展方面发挥作用。但也有一些资料显示ABCA1可增加单核/巨噬细胞中白介素—1β、氧自由基的表达,其临床意义未明。 目前,已公认ABCA1是影响HDL-C水平及逆胆固醇转运的重要基因,但ABCA1在AS发生中的作用及其机制仍未完全明确,本研究拟从细胞水平及人体水平两方面探讨ABCA1对炎症因子的调节在AS发生中的作用。细胞水平研究包括ABCA1对Ox-LDL、8-Br-cAMP诱导的THP-1巨噬细胞中炎症因子mRNA、蛋白质表达的影响及信号转导机制,并应用电镜观察有无病理意义的组织学变化;人体水平研究包括ABCA1基因多态性对炎症因子的影响,ABCA1对冠心病患者血浆HDL-C及炎症因子表达的影响及其相互关系。通过研究明确ABCA1对炎症因子的调节机制及临床意义。 【方法、分组及目的】 细胞水平研究: 研究目的:探讨Ox-LDL、8-Br-cAMP诱导下ABCA1对炎症因子的影响及信号转导机制,并通过形态学证实能否导致细胞结构的病理性改变。 研究方法:选择THP-1人巨噬细胞,采用荧光定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质免疫印迹技术(Weatern Blot)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)分别观察Ox-LDL、8-Br-cAMP刺激对细胞ABCA1、ICAM-1、MCP-1及IL-1β的mRNA和蛋白质水平的影响,以及ABCA1反义寡核苷酸抑制ABCA1表达后上述细胞因子的变化。 在以上研究结果的基础上,应用ELISA法观察Ox-LDL、8-Br-cAMP刺激下,ABCA1调节炎症因子表达的信号转导机制。 同时应用电子显微镜观察不同实验组巨噬细胞结构的改变。 临床水平研究: 研究目的:已有文献报道:细胞水平ABCA1的作用与人体整体中ABCA1的作用不同,以上研究证实细胞水平ABCA1可调节炎症因子的表达,为证实在病人整体水平ABCA1与炎症因子的关系,选用冠心病人,筛选出ABCA1对HDL-C有明显影响及无明显影响的两个SNP位点(R1587K、M883I),探讨ABCA1不同基因型对炎症因子有无影响,HDL-C与炎症因子有无相关性,从而证明ABCA1在影响HDL-C时对炎症因子有无调节作用。 研究方法:选临床冠心病病人112例,正常对照108例,两组年龄、性别无显著性差异。提取基因组DNA,采用引物引入限制性内切酶分析聚合酶链反应(PIRA-PCR)方法扩增ABCA1外显子18、35,并用内切酶EcoR V、BssS I分别对18外显子M883I、35外显子R1587K SNP行酶切分析。同时应用ELISA法检测冠心病组IL-1β、ICAM-1、MCP-1、高敏C反应蛋白(hs-CRP),统计上述炎症因子与基因型、HDL-C的关系及其相关性。 细胞水平研究方法步骤: 1.THP-1人巨噬细胞的培养 复苏THP-1人单核细胞株,取传3~4代后细胞,加入氟波酯(PMA,终浓度100nmol/L)培养72 h,使之转变为THP-1人巨噬细胞,实验前以无血清的RPMI1640培养12h,使实验所用细胞处于静止状态。在无血清培养基中加入牛血清白蛋白(BSA)2 mg/mL作为血清替代物,加入各种刺激因子进行实验。 2.Ox-LDL、8-Br-cAMP对THP-1巨噬细胞中ABCA1、ICAM-1、MCP-1mRNA表达的影响: 细胞培养同上,加入Ox-LDL(30mg/L)、8-Br-cAMP(0.5mmol/L)与THP-1共同孵育3、6、12、24小时,设未加刺激同时孵育24小时的细胞为对照组,按时收集细胞,提取细胞的总RNA,荧光定量RT-PCR检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1mRNA。内参照采用β-Actin。 3.Ox-LDL、8-Br-cAMP对THP-1巨噬细胞中ABCA1、ICAM-1、MCP-1、IL-1β蛋白质的影响: 细胞培养同上,加入Ox-LDL(30mg/L)、8-Br-cAMP(0.5mmol/L)与THP-1共同孵育3、6、12、24小时,设未加刺激同时孵育24小时的细胞为对照组,按时收集细胞,提取细胞的总蛋白,蛋白质免疫印迹技术检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1蛋白质表达;ELISA法检测各组ICAM-1、MCP-1、IL-1β蛋白质水平。 4.反义寡核苷酸抑制ABCA1对THP-1巨噬细胞中ABCA1、ICAM-1、MCP-1mRNA的影响: THP-1巨噬细胞加入ABCA1反义寡核苷酸放置5小时,用含2mg/ml BSA的Ox-LDL(30mg/L)、8-Br-cAMP(0.5mmol/L)与THP-1细胞共同孵育3、6、12、24小时,设未加刺激同时孵育24小时的细胞为对照组,按时收集细胞。荧光定量PCR检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1mRNA。 5.反义寡核苷酸抑制ABCA1对THP-1巨噬细胞中ABCA1、ICAM-1、MCP-1蛋白质的影响: THP-1巨噬细胞加入ABCA1反义寡核苷酸放置5小时,用含2mg/ml BSA的Ox-LDL(30mg/L)、8-Br-cAMP(0.5mmol/L)与THP-1细胞共同孵育3、6、12、24小时,设未加刺激同时孵育24小时的细胞为对照组,按时收集细胞提取蛋白质,蛋白质免疫印迹法及ELISA法检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1、IL-1β蛋白质表达的影响。 6.ABCA1对Ox-LDL、8-Br-cAMP诱导THP-1巨噬细胞中炎症因子表达的信号转导机制研究 Ox-LDL:研究分为对照组、Ox-LDL组、反义寡核苷酸组、p38阻滞剂组。细胞培养同上,反义寡核苷酸组、p38阻滞剂组分别加入ABCA1反义寡核苷酸、p38信号转导阻滞剂5 h,更换为含2 mg/ml BSA的Ox-LDL(30 mg/L)与THP-1巨噬细胞共同孵育24 h;Ox-LDL组用含2 mg/ml BSA的Ox-LDL(30 mg/L)与THP-1巨噬细胞共同孵育24 h;未加刺激同时孵育24 h的细胞为对照组。ELISA法检测IL-1β蛋白质。 8-Br-cAMP:研究分为对照组、8-Br-cAMP组、反义寡核苷酸组、p38阻滞剂组。细胞培养同上,反义寡核苷酸组、p38阻滞剂组分别加入ABCA1反义寡核苷酸、p38信号转导阻滞剂5 h,更换为含2 mg/ml BSA的8-Br-cAMP(0.5mmol/L)与THP-1巨噬细胞共同孵育24 h;8-Br-cAMP组用含2 mg/ml BSA的8-Br-cAMP(0.5mmol/L)与THP-1巨噬细胞共同孵育24 h;未加刺激同时孵育24 h的细胞为对照组。ELISA法检测IL-1β蛋白质。 7.Ox-LDL、8-Br-cAMP刺激对THP-1巨噬细胞显微结构的影响及其ABCA1反义寡核苷酸、p38抑制剂的保护作用 细胞培养及分组同信号转导机制研究,透射电镜样本的制作:取培养24小时细胞,1500rpm/min离心5分钟,加4℃2.5%戊二醛前固定48小时,漂洗后1%锇酸后固定1.5小时,逐级脱水后包埋,切片,醋酸双氧铀一枸橡酸铅双染色法染色,HITACHI H—600四型透射电子显微镜下观察。 临床病人研究方法步骤: 1.观察人群的确定 观察人群分为冠心病组及正常人组。冠心病组:112例,男79例,女33例,年龄60.76±11.27岁;正常人组108例,男性74例,女性34例,年龄59.89±7.92岁。两组年龄、性别无显著性差异。 2.炎症因子及血脂生化指标检测 清晨抽取静脉血,分离血浆,ELISA法检测炎症因子(IL-1β、ICAM-1、MCP-1、Hs-CRP),酶法测定总胆固醇(TC)、总甘油三脂(TG),直接一步法测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)。 3.PCR扩增及限制性内切酶分析 用PCR扩增ABCA1基因35外显子R1587K、18外显子M883I片断,采用引物引入限制性内切酶分析聚合酶链反应(PIRA-PCR)方法。酶切反应体系20μl,含PCR产物8μl、10×NEB Buffer2μl、去离子水9μl,含R1587K的PCR产物用特异性限制性内切酶BssS I 4U、含M883I的PCR产物用EcoR V 4U,置于37℃水浴过夜。2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。 【结果】 1.ABCA1对Ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞中炎症因子mRNA、蛋白质表达的影响机制及其意义 Ox-LDL刺激3小时后即出现ABCA1、ICAM-1、MCP-1 mRNA及蛋白质表达的增高,mRNA表达的高峰期为6小时,蛋白质表达的高峰期为12小时。给予反义寡核苷酸转染后Ox-LDL刺激3、6小时mRNA的表达降低,12、24小时蛋白质的表达降低。 加入ABCA1反义寡核苷酸或p38抑制剂刺激后在用Ox-LDL诱导,THP-1中IL-1β水平较单纯Ox-LDL诱导组细胞中IL-1β水平明显降低。 电镜显示:Ox-LDL组细胞细胞器数量减少,线粒体及内质网结构不清晰,部分线粒体嵴模糊,空泡明显增多,细胞内可见扩张内质网中包裹的损伤细胞器,核周间隙增宽,基质散乱。ABCA1反义寡核苷酸或p38阻滞剂可明显减轻细胞结构的损害。 2.ABCA1对8-Br-cAMP诱导的THP-1巨噬细胞中炎症因子mRNA、蛋白质表达的影响机制及其意义 8-Br-cAMP刺激3小时后即出现ABCA1、ICAM-1、MCP-1 mRNA及蛋白质表达的增高,mRNA表达的高峰期为6小时,蛋白质表达的高峰期为12小时。给予反义寡核苷酸转染后8-Br-cAMP刺激3、6小时mRNA的表达降低,12、24小时蛋白质的表达降低。 加入ABCA1反义寡核苷酸或p38抑制剂刺激后在用8-Br-cAMP诱导,THP-1中IL-1β水平较单纯8-Br-cAMP诱导组细胞中IL-1β水平明显降低。 电镜显示:THP-1对照组、8-Br-cAMP组、反义寡核苷酸组及p38阻滞剂组THP-1细胞膜结构清晰,胞浆内可见清晰的线粒体、粗面内质网、溶酶体、吞噬体,核膜清晰,细胞核正常。 3.ABCA1对冠心病患者血浆HDL-C及炎症因子表达的影响及其相互关系 R1587K位点冠心病组及正常人组K携带者HDL-C水平均明显低于非携带者,R1587K基因型对冠心病组及正常人组HDL-C水平的影响有显著性。但同时冠心病组R1587K基因型对炎症因子(IL-1β、ICAM-1、MCP-1、hs-CRP)无显著影响,HDL-C水平与炎症因子水平无相关性。M883I基因型对冠心病患者HDL-C水平无明显影响,同时各基因型间炎症因子也无显著改变。联合分析R1587K及M883I多态性对冠心病患病风险影响发现,与携带1587RR和883MM或MI基因型比较,携带其他组合基因型者冠心病患病风险无明显降低。 【结论】 1.ABCA1可增加THP-1人巨噬细胞中Ox-LDL诱导的炎症因子(IL-1β、ICAM-1、MCP-1)的表达,并引起巨噬细胞结构损伤。 2.ABCA1可增加THP-1人巨噬细胞中8-Br-cAMP诱导的炎症因子(IL-1β、ICAM-1、MCP-1)的表达,但Ox-LDL不同,8-Br-cAMP不引起巨噬细胞结构损伤。 3.THP-1人巨噬细胞中ABCA1可能通过p38—ABCA1—IL-1β通路引起Ox-LDL/8-Br-cAMP诱导的ICAM-1、MCP-1表达增加。 4.ABCA1 R1587K及M883I多态性不影响炎症因子(IL-1β、ICAM-1、MCP-1、Hs-CRP)的表达,R1587K调节冠心病患者及正常人HDL-C水平,对冠心病患者血浆炎症因子的表达水平无影响。 5.在细胞水平,ABCA1不仅可增加细胞内胆固醇外流,还具有增加THP-1人巨噬细胞中炎症因子表达功能;在人体水平,ABCA1 R1587K影响HDL-C,但不影响炎症因子的表达。……