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肠杆菌科细菌qnrB介导的喹诺酮类药物耐药机制的研究

马晓波

   研究背景及目的: 1998年Martinez-Martinez等最早发现在肺炎克雷伯菌UAB1上存在质粒介导的喹诺酮类耐药机制(Plasmid-Mediated Quinolone Resistance,PMQR)。Qnr通过与DNA回旋酶及拓扑异构酶Ⅳ结合而抑制环丙沙星的作用从而导致大肠埃希菌J53接合子的耐药性升高。不少研究显示qnr在全球范围内存在。迄今已发现qnr多个亚型,如qnrA、qnrB、qnrS、qnrC。2006年美国学者发现的qnrB是一种全新的基因型,与qnrA1的核苷酸同源性仅为49.5%(氨基酸同源性39.5%),其分布有待研究,来源尚不清楚。目前仅印度、美国、台湾和韩国有关于检出qnrB的报道,qnrB常与产SHV-12、CTX-M-15、IMP-8与DHA等β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌密切相关。我们对2005年10月至2006年4月间我院分离的120株头孢菌素耐药的肠杆菌科细菌进行PCR检测、接合验证等以研究qnrA、qnrB的分布,同时对qnr阳性菌株产SHV或CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶的情况进行初步分析,从而为PMQR的进一步研究提供实验依据。 方法: 1.细菌的鉴定和药敏采用Microscan Walkaway 40~(?)全自动细菌鉴定及药敏分析系统。 2.采用碱裂解变性法(E.Z.N.A~(TM) plasmid mini Kit)提取细菌质粒DNA,PCR法检测qnr的存在,qnrA和qnrB的引物分别为A-F(5’-ATTTCTCACGCCAGGATTTG)、A-R(5’-GAGATTGGCATTGCTCCAGT)及MFQ1、MFQ2,产物大小分别为413bp、469bp,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳、成像。每次均设阳性对照和阴性对照,参考菌株Kpneumoniae UAB1(gnrA)及E.coli J53.plus pMG298(gnrB)由上海华山医院抗生素研究所王明贵教授和美国Lahey Clinic的G.A.Jacoby教授馈赠。 3.接合实验验证qnr的转移性,受体菌为E.coli J53(Azide resistant),对接合子的选择采用含100μg╱mL氨苄西林、100μg/mL叠氮钠、8μg╱mL头孢噻肟的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA),将接合子分别接种至含与不含0.06μg/mL环丙沙星的TSA平板上观察喹诺酮类药物耐药性的转移。 4.比较受体菌、供体菌及接合子的MIC值,包括多种喹诺酮类药物,采用琼脂对倍稀释法。 5.PCR法分别检测qnrA、qnrB阳性菌株orf513或orf1005的存在。采用引物qnrB/B’-CDS扩增qnrB的全序列,由Invitrogen公司采用ABIPRISM~(TM) 3730XL DNA Analyzer测序,结果于www.ncbi.nlm.nih.gov上进行GenBank+EMBL+DDBJ比对。 6.对来自同一患者的不同菌种进行检测以了解qnr在体内是否存在水平传播。一株鲍曼不动杆菌同时包含qnrA、qnrB,纯化PCR产物后连接到pMD-18T载体上,转化至E.coli DH5α感受态细胞内,采用抗生素平板筛选单克隆菌落。对经PCR鉴定的阳性克隆,提纯质粒DNA完成测序。 7.采用Nitrocefin法检测供体菌产β-内酰胺酶情况,改良三维实验了解细菌产酶表型,Multiplex-PCR法检测bla_(SHV)、bla_(CTX-M)及多种质粒型AmpC酶的b/a基因(包括DHA、MOX、CIT、ACC、FOX等)。 结果: 1.qnr的检出:120株肠杆菌科细菌中,分别有37株含qnrA,33株含qnrB,其中13株同时检出qnrA、qnrB;其中肠杆菌属、克雷伯菌属细菌及大肠埃希菌qnr的检出率分别为52.9%、57.1%和50.0%。 2.接合实验:除一株肺炎克雷伯菌外其余56株接合子均能在TSA选择平板上生长;而一株接合子在含环丙沙星的TSA上不能生长。 3.MIC测定:各种抗菌药物对接合子的MIC值较受体菌均有不同程度提高。仅加替沙星、头孢吡肟对qnr阳性菌株的抗菌活性相对较好。 4.orf513及orf1005检测:qnrA、qnrB阳性菌株中各有7株检测到Drf513或orf1005的存在。 5.qnrB全序列扩增:18株细菌可扩增出681bp或645bp的全序列片段。部分菌株的qnrB序列与qnrB1(DQ351241)完全一致,但4株细菌的qnrB序列与qnrB3(DQ303920)相比,存在3个位点核苷酸序列突变(201 A→T,271位T→G,498位G→A)而导致相应编码蛋白的氨基酸存在两个位点差异:第67位、91位分别由赖氨酸、丝氨酸变成天冬酰胺及丙氨酸(K67N,S91A)。 6.qnr在患者体内水平传播:5个患者在首次检出qnr后,相同患者后续分离到的其它菌种中(7株/5人),仅1株不含qnr基因。且对于同一患者,后续分离到的菌株与首次检出株含有同一类型的qnr,也可能同时包含qnrA、qnrB。鲍曼不动杆菌的qnrB部分序列与qnrB1完全一致,qnrA部分序列与qnrA1相比有一个核苷酸改变(167位C→T)。 7.供体菌β-内酰胺酶检测:所有细菌均可使Nitrocefin纸片变红色;33株细菌产ESBLs或AmpC酶。49株(89.1%)供体菌包含bla_(SHV)或bla_(CTX-M);约70.0%的qnr阳性菌可检测到AmpCβ-内酰胺酶相关的bla基因,以DHA型及MIR-1T、ACT-1型为主。 结论: 1.2005年10月-2006年4月我院临床存在qnr阳性菌株的流行,本研究在国内首次发现qnrB介导的喹诺酮类药物的耐药机制; 2.发现一种与qnrB3最为接近的新的qnrB样基因亚型; 3.首次在聚团多源菌、鲍曼不动杆菌中检出qnr的存在; 4.包含qnr菌株多为产ESBLs或AmpC型β-内酰胺酶的临床分离肠杆菌科细菌,qnrB常与bla_(SHV)或bla_(CTX-M)、bla_(DHA)关系密切。……   
[关键词]:质粒介导的喹诺酮类药物耐药;qnrB;分子机制;bla基因;肠杆菌科细菌;水平传播
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川大学2007年