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异种小血管支架的实验移植机制与CD34阳性细胞生物学特性的研究

陈华勇

   在器官移植领域,移植血管占有重要地位,已成为治疗血管疾病的有效方法。迄今许多患血管疾病患者通过移植自身血管、同种异体血管获得新生。然而,有两个因素严重阻碍了临床血管移植术推广应用:①自身血管、同种异体血管的供体数量有限,甚至影响供体相应组织器官的血液供应;②免疫抑制剂的毒副作用。为解决供体血管短缺问题,人们开始探讨异种血管移植。异种血管移植是将一个种属个体血管移植给另一种属个体体内,以发挥生理功能,治疗血管疾病。要使异种血管移植获得成功,就要解决异种移植物的强烈免疫排斥反应问题。用何种方法使异种血管免疫源性降到最低水平,从而延长移植物在宿主体内的生存寿命,是解决异种血管免疫排斥反应的最关键点。在组织工程领域,研究开发具有来源广泛、具备良好通畅性、抗血栓性、受体组织相容性、有活力、耐久性、易操作性和经济性的理想组织工程血管,已成为当务之急。组织工程血管的重建需要两个必要的物质条件:①血管支架材料;②血管种子细胞。血管支架材料分为天然支架材料和合成多聚体材料。前者为直接取自生物体尤其是哺乳动物组织器官,经特殊处理后作为细胞种植支架,然后种植受体种子细胞,重建组织工程血管。这种材料中具有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸序列。这种序列是可被细胞膜上存在的整合素受体所识别的配体,参与加速细胞分裂、形态发生和分化的生理活动。作为血管组织工程种子细胞,人们多采用受体血管内皮细胞。但内皮细胞培养需要时间,并传代后受内皮细胞自身寿命限制。骨髓中的CD34阳性细胞能分化为血管内皮细胞。如果利用骨髓CD34阳性细胞以抗CD34单克隆抗体为媒质,与异种血管支架结合,使CD34阳性细胞在支架内稳定生长繁殖,那末重建异种新型天然支架血管壁成为可能。本项目的研究,重点探讨异种小血管支架材料的实验性移植应用的可行性和种子细胞的生物学特性,为重建组织工程小血管提供实验依据。同时为未来的临床血管移植应用开辟新的途径。 实验材料和方法 1.实验动物的选取:Wistar大鼠95只,雌雄不拘,体重318.50g-588.81g;日本大耳白兔67只,雌雄不限,体重1.75kg-3.50kg。将实验动物分为四个组:①正常对照组:Wistar大鼠5只和日本大耳白兔7只;②异种小血管支架(移植)组:Wistar大鼠45只;③异种小血管(移植)组:Wistar大鼠45只;④异种宿主(受体)组:日本大耳白兔60只,左右耳各1例/只,共120例。 2.采用TritonX-100脱细胞血管支架法,Romeis地衣红弹性纤维染色法、Mallory-Heidenhain快速一步胶原纤维染色法、De Rio-Horetga网状纤维染色法、常规H.E染色法对所取血管支架管壁组织染色观察。利用扫描电镜、透射电镜观察法,观测供体和受体实验血管壁内皮细胞和平滑肌细胞与细胞外基质。 3.采用显微外科血管吻合技术,近侧断端以套叠吻合法吻合异种小血管支架或异种小血管与宿主动脉,远侧断端利用端端吻合法吻合,用勒通试验法直接检测移植血管术后血流通畅状况。 4.采用亲和组织化学方法,检测供体和受体实验血管细胞早期生长反应基因的表达和骨髓CD34阳性细胞CD34抗原的表达。 5.采用加入内皮细胞诱导剂的细胞培养技术,培养骨髓细胞。 实验结果 1.小血管支架内膜和中膜呈海绵状,胶原纤维、弹性纤维和网状纤维立体网络状排列,以胶原纤维为主要成分。 2.Wistar大鼠尾动脉和日本大耳白兔耳背面中央动脉内膜的内皮细胞和中膜的平滑肌细胞α-Gal与BSI-B4亲和反应,以内皮细胞α-Gal表达为主。Wistar大鼠尾动脉内皮细胞α-Gal表达强于日本大耳白兔中央动脉内皮细胞。小血管支架α-Gal阴性或弱阳性表达。 3.供体血管与受体血管间置移植吻合术后,即刻通畅率100%。48小时连续观察移植术后血流状况,异种小血管支架通畅时间最长46小时47分,异种小血管最长为14小时。移植血管吻合区首先在端端吻合口出现血栓,进而发展到套叠吻合区血管内形成血栓、血栓再通、血栓机化,内膜和中膜增殖向血栓内生长,形成新的肉芽组织。移植术后第100天,异种小血管支架仍保持原来初始的外形结构。 4.供体血管支架移植到受体断端血管之间第10分钟,受体血管细胞已有Egr-1表达,24小时趋于平稳。异种小血管细胞术后第30分钟Egr-1表达阳性。 5.骨髓CD34阳性细胞形态不一,体积较大者CD34抗原表达较弱,单个散在;体积较小者CD34抗原表达较强,多个细胞聚在一起。用内皮细胞生长添加剂诱导出培养中的骨髓细胞向内皮细胞分化趋势。CD34阳性细胞密度值为154.53±88.04个/mm~2。 6.在日本大耳白兔耳前边缘静脉内膜发现类内皮细胞,细胞间以线状结构相连;培养中的日本大耳白兔外周血有核细胞克隆之间有丝状或蜘蛛网状结构。 结论 1.本实验建立的小血管支架模型为脱细胞的Wistar大鼠尾动脉干基质。小血管支架的构成本质为以胶原纤维为主、弹性纤维和网状纤维相互密集排列的立体网络状结构。 2.日本大耳白兔中央动脉和Wistar大鼠尾动脉的管壁内皮细胞和平滑肌细胞α-Gal表达呈阳性,而脱细胞的小血管支架呈弱阳性或阴性。日本大耳白兔中央动脉内皮细胞和Wistar大鼠尾动脉内皮细胞α-Gal表达不仅表现在细胞膜上,在细胞核中也有强表达。Wistar大鼠尾动脉内皮细胞异种抗原性强于日本大耳白兔中央动脉。 3.异种小血管支架可作为血管移植物吻合于异种动物宿主体内,到第100天时仍保留着其较完整结构。 4.异种小血管支架血液通畅平均时间为(42.26±2.42)小时,最长时间为46小时47分;异种小血管通畅平均时间为(11.12±0.33)小时,最长时间为14小时。异种小血管支架移植通畅效果优于异种小血管移植。 5.异种小血管支架和异种小血管移植术后形成的血栓主要为混合型血栓,在术后不同时间出现再通现象,并逐渐机化,内膜向血栓内长入形成肉芽组织,中膜也有不同程度的增生。 6.异种小血管支架移植的套叠式吻合法优于经典的端端吻合法。 7.异种小血管支架移植术后24小时内表达Egr-1阴性6异种小血管支架和异种小血管在移植术后第10分钟,受体动脉远侧和套叠区内的受体动脉管壁内皮细胞和平滑肌细胞Egr-1表达阳性。异种小血管干管壁内皮细胞和平滑肌细胞在移植术后第30分钟Egr-1表达。 8.异种小血管支架移植物受体动脉远侧内皮细胞和平滑肌细胞Egr-1表达由强减弱,异种小血管移植物受体动脉远侧由弱渐强。异种小血管内皮细胞和平滑肌细胞Egr-1表达由弱增强的诱导因素可能是细胞分泌的组织细胞因子,进而促进内膜增生,平滑肌细胞增殖,易引起管腔狭窄。 9.日本大耳白兔骨髓内含有CD34阳性细胞。日本大耳白兔骨髓内的CD34阳性细胞密度值为154.53±88.04个/mm~2。根据形态和CD34抗原表达位置和强度的不同,分为大型CD34阳性细胞和小型CD34阳性细胞。 10.兔耳前边缘静脉内含类内皮细胞;以线状结构相连也是细胞间连接方式之一。 11.在日本大耳白兔外周血有核细胞克隆之间,存在丝状或蜘蛛网状结构,这种结构可能与细胞克隆之间的信息传递有关。……   
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