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人MxA基因重组真核载体抗乙型肝炎病毒作用的实验室研究

黄琴

   第一部分人MxA基因重组真核载体的构建及鉴定 目的:在前期获得含有目的基因MxA的PAdtrack-MxA(含MxA的重组腺病毒穿梭质粒)基础上,应用真核载体PcDNA3.1构建重组真核载体PcDNA3.1-MxA。 方法:在大肠杆菌JM109中扩增获得含有目的基因MxA的PAdtrack-MxA和PcDNA3.1,使用两者共同的限制性内切酶Xba I、Not I进行双酶切,并连接以构建重组真核载体PcDNA3.1-MxA,然后通过氨苄青霉素抗性筛选,双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序,并应用DNAssist 2.0软件对序列与前期获得的基因序列以及已知GenBank中MxA基因序列进行同源性分析。 结果:经限制性内切酶、PCR鉴定重组真核载体PcDNA3.1-MxA构建成功。测序结果表明本实验所克隆片段长2012bp,包含人MxA基因序列,核苷酸序列分析表明与前期获得的目的基因序列完全相同,而与GenBank中人MxA基因序列同源性也达99.75%,仅有5个碱基不同,且所编码的氨基酸仅1个发生改变,此氨基酸位于MxA蛋白的非功能区。 结论:重组真核载体PcDNA3.1-MxA构建成功,为下一步研究MxA抗乙型肝炎病毒作用奠定了基础。 第二部分人MxA基因重组真核载体抗乙型肝炎病毒作用的实验室研究 目的:体外研究PcDNA3.1-MxA体外抗HBV的作用,为进一步研究体内抗病毒及临床应用提供理论和实验基础。 方法:将构建成功的重组真核载体PcDNA3.1-MxA转染入HepG 2.2.15,根据PcDNA3.1-MxA新霉素抗性,使用G418抗性筛选出稳定的细胞克隆。将HepG 2.2.15分为实验组(稳定表达PcDNA3.1-MxA的HepG 2.2.15)和对照组(未转染组),应用RT-PCR方法检测两组HepG2.2.15内MxA mRNA水平的表达,并应用ELISA法检测两组HepG2.2.15内HBsAg、HBeAg的水平。 结果:经浓度梯度筛选显示G418最适筛选浓度为600μg/ml,并在培养第3周筛选出稳定表达PcDNA3.1-MxA的HepG 2.2.15。RT-PCR扩增结果显示实验组的MxA mRNA水平均较对照组明显升高,而且ELISA检测结果显示实验组HBsAg、HBeAg水平明显低于对照组,其结果具有显著的统计学意义(P﹤0.01)。 结论:在HepG 2.2.15内成功转染并稳定表达重组真核载体PcDNA3.1-MxA,PcDNA3.1-MxA能抑制HepG 2.2.15中HBV的复制及表达。……   
[关键词]:MxA;PcDNA3.1;PcDNA3.1-MxA;PcDNA3.1-MxA;HepG 2.2.15;HBV复制及表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:重庆医科大学2007年