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姬松茸多糖的提取纯化及注射液的研制

刘翠

   姬松茸(Agaricus blazei Murill,ABM)是近年来新兴的一种食药兼用菌,因其富含多种活性成份,可作为免疫调节剂、抗癌剂、抗突变剂和抗菌物质的来源,因而引起全世界的极大关注。由于姬松茸具有多种生物活性,具有广泛的应用价值和前景,因而对其活性成分的提取分离就显得尤为重要。对于姬松茸多糖的提取分离纯化过程国内外有很多报道,技术比较成熟,但是以姬松茸多糖为主原料的保健食品或抗癌药物目前还少有报道。本论文以姬松茸粗多糖为原料,开发姬松茸多糖注射液,为其作为一种新型的抗癌辅助药物走向市场奠定实验依据。 为保证姬松茸多糖注射液的安全性,根据《中华人民共和国药典》及《中药、天然药物提取纯化工艺的相关规定》,选取了经济、安全、高效的分离、纯化、浓缩和干燥方法。首先Sevage法除蛋白,根据文献,确定氯仿:正丁醇为3:1,多糖浓度2mg·mL~(-1)时,重复三次,除蛋白效果最佳;脱色采用了双氧水氧化法,为加快脱色时间,又要避免双氧水对多糖结构的破坏,实验在37℃下进行;透析、浓缩、干燥过程同样为了保证多糖结构的完整性和提取后物质疏松易溶解,先透析,然后60℃浓缩,最后是冷冻干燥。此时得到的多糖半纯品(AB)呈褐色,粉末状,经苯酚硫酸法和考马斯亮蓝G250法测得总糖含量和蛋白质含量分别为85.4%和14.2%。多糖半纯品通过DEAE-纤维素离子交换层析进行初步分级纯化,用0、0.1、0.3mol·L~(-1)的NaCl洗脱,得到三个组分,分别是AB-Ⅰ、AB-Ⅱ和AB-Ⅲ,其中AB-Ⅰ为中性多糖,AB-Ⅱ和AB-Ⅲ为酸性多糖。AB-Ⅰ、AB-Ⅱ和AB-Ⅲ分别再通过Sepharose CL-4B凝胶层析进一步分级,AB-Ⅰ得到单一对称峰,透析干燥后为淡黄色粉末,AB-Ⅱ和AB-Ⅲ在主峰之前分别有一小峰,收集主峰,得到AB-Ⅱ-b和AB-Ⅲ-b,透析干燥后分别呈黄色和褐色粉末。AB-Ⅰ、AB-Ⅱ-b和AB-Ⅲ-b经纯度鉴定后,表明为均一的多糖,总糖含量为91.8%、90.4%和89.2%,蛋白质含量为7.1%、8.8%和9.3%。 为了进一步探讨分离纯化的多糖半纯品AB及其组分AB-Ⅰ、AB-Ⅱ-b和AB-Ⅲ-b的免疫药理作用,我们使用环磷酰胺建立了小鼠免疫低下模型,并对多糖处理前后小鼠的免疫功能变化情况进行了检测,如免疫器官重量试验、外周血血象测定、腹腔巨噬细胞吞噬试验、溶血素生成试验、E玫瑰花环形成试验、淋巴细胞转化试验,从非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫方面全面检测它们的免疫药理作用。结果表明环磷酰胺致小鼠免疫低下模型建立成功,四个多糖均能弱化环磷酰胺对机体的毒副作用,并且有的指标能达到空白对照组水平,正常小鼠经四个多糖免疫后,与空白对照组相比除淋巴细胞转化试验外,均为差异极显著(P<0.01);在淋巴细胞转化试验中,AB-Ⅲ-b与空白对照组、AB和AB-Ⅰ组比较差异显著(P<0.05),AB、AB-Ⅰ和AB-Ⅱ-b组与空白对照组比较差异不显著(P>0.05)。AB-Ⅲ-b在免疫器官重量试验和溶血素生成试验中,同AB、AB-Ⅰ和AB-Ⅱ-b组比较也是差异极显著(P<0.01),说明AB-Ⅲ-b具有较好的提高机体免疫力的作用。 在上述研究的基础上对姬松茸多糖注射液的生产工艺进行了设计,初步制得注射液成品,根据《中华人民共和国药典》和《中药、天然药物相关的技术指导原则》对注射液的中间体进行质量安全性试验:急性毒性试验、肌肉局部刺激试验、过敏试验和溶血试验,试验结果均符合相关规定,表明姬松茸多糖注射液可以用于肌肉注射和静脉注射,无毒副作用,不会产生不良后果。 综上所述,姬松茸多糖是一种良好的免疫增强剂,可以弱化环磷酰胺对机体的毒副作用,初步制得注射液后,肌肉和静脉注射对机体无不良效果,如果应用于临床可与常规化疗药物配伍使用,加大疗效,保护正常细胞免受药物损伤,因此可以开发作为新型抗癌辅助药物,造福人类。……   
[关键词]:姬松茸;多糖;提取纯化;免疫低下;注射液
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2007年