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TGEV纤突糖蛋白保护性抗原基因克隆、测序及表达

鲁娜

   猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of pigs,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪对本病都易感,2周龄以内的仔猪具有高度感染性,以仔猪呕吐、严重腹泻和脱水为主要临床特征,致死率可达100%。本病常常由于混合感染和细菌继发感染,难以确诊,缺乏有效疫苗,给各国养猪业带来极大危害。 对TGEV的研究表明,S基因编码的S蛋白,是诱导机体产生中和抗体和提供黏膜免疫保护作用主要的结构蛋白。其上的重要保护性抗原位点A、D,在诱导机体产生中和抗体中起关键作用。A位点缺失可导致S蛋白不能产生中和抗体,丧失黏膜免疫保护功能。D位点在中和抗体产生中也起着重要的作用。由此可见,对于S基因重要保护性抗原位点A、D基因的克隆及表达的研究就显得尤为重要。 本研究根据Genbank上发表的TGEV-TH-98株S基因cDNA序列,设计并合成了一对扩增A、D位点的引物P1,P2。将自行分离的TGEV-JL毒株接种于单层PK-15细胞增殖病毒。提取TGEV-JL株基因组RNA,通过RT-PCR扩增出含A、D两抗原位点的目的片段S_1基因,片段大小为1218bp。将S_1基因克隆到pMD18-T克隆载体,构建成重组质粒pMD18-S_1。对pMD18-S_1进行鉴定后,再将S_1基因亚克隆到pET-32a原核表达载体的EcoRⅠ和SalⅠ之间的多克隆位点上,进而构建了重组原核表达质粒pET-S_1。将重组表达质粒pET-S_1转化到表达宿主菌BL21中,用终浓度为1mmol/L的IPTG对宿主表达菌诱导表达。经SDS-PAGE分析表达产物,结果表明:S_1基因在原核表达系统pET-32a中获得表达,表达的重组蛋白大小约为44KD。Western-blot检测表明,表达的重组蛋白能够被TGEV阳性血清所识别。由此说明,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。 上述结果提示,克隆的S_1基因读码框架正确,可在乳酸杆菌中得到表达,为下一步构建乳酸杆菌穿梭表达载体,研制乳酸杆菌基因工程疫苗奠定基础。同时,该原核表达载体的构建及表达成功,为TGE诊断研究奠定基础。……   
[关键词]:TGEV-JL株;S_1基因;克隆;原核表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2007年