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大蒜病毒病原鉴定及其检测技术研究

张威

   通过调查发现黑龙江省大蒜普遍受到病毒的复合侵染,侵染后的田间症状多样,主要有花叶、皱缩、卷叶、畸形、黄化、坏死和矮化等。本试验通过生物学、电子显微镜技术、血清学及分子生物学方法对大蒜病毒病原进行检测与鉴定研究。 通过生物学试验用大蒜病毒接种鉴别寄主,对大蒜病毒病原进行初步鉴定。明确了韭葱是LYSV很好的鉴别寄主和繁殖寄主,洋葱是OYDV很好的鉴别寄主和繁殖寄主,蚕豆是GCLV很好的鉴别寄主,千日红是PVX很好的鉴别寄主。 对大蒜和接种发病鉴别寄主病毒粗提液通过负染色法制片在电镜下观察到线状(300-1000nm)和长线状(1850-2000nm)两种病毒粒子;电镜超薄切片观察,发现了线状和弹状两种病毒粒子,都分布在细胞质中形成各种内含体。其中弹状和长线状病毒粒子首次在大蒜病叶中发现。 发病寄主叶片的DAS-ELISA检测结果:花叶症状的大蒜样品中含有LYSV和PVX,黄化症状的大蒜样品中含有OYDV和GCLV,卷叶症状的大蒜样品中含有GCLV、LYSV和OYDV。其中,PVX首次在大蒜上检测到。对黑龙江省大蒜病毒病原进行调查及DAS-ELISA检测结果表明:37份大蒜田间样品中LYSV、GCLV、OYDV、ShLV和PVX的检出率分别为95%、86%、74%、50%和78%,且多数为复合侵染。 依据GCLV CP区域的保守序列设计并筛选了一对引物,以带毒植物总RNA为模板,进行反转录和PCR扩增,通过反应体系和反应程序的建立与优化,扩增得到长300bp的目的片段,并对其进行了克隆与序列测定。测序结果与GenBank中其他GCLV相应区域的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性最高达97%。并验证了该检测体系的特异性与灵敏度。 依据LYSV核苷酸保守序列设计合成了一对引物,以带毒植物总RNA为模板,进行反转录和PCR扩增,并对目的片段进行了克隆与序列测定,得到1032bp的目的片段,其中包括LYSV的整个CP序列。测得的LYSV黑龙江分离物HLJ与已知23个不同分离物CP核苷酸序列同源性最高达88.6%,氨基酸序列同源性最高达93.1%,证明成功地扩增到LYSV CP基因。LYSV不同分离物间CP氨基酸序列存在明显差异,同源性在75.8%~100%之间。LYSV的系统进化树可划分为4大类群,其中LYSV黑龙江分离物HLJ与南韩和日本大蒜上的LYSV有较近的亲缘关系,同属于ⅳ类,表现一定的地域相关性。 依据PVX CP序列设计合成了一对引物,以带毒植物总RNA为模板,在相同的反应条件下,对大蒜与马铃薯上的PVX同时进行RT-PCR扩增,均扩增得到长714bp的目的片段,并对其进行了克隆与序列测定。测得的PVX黑龙江大蒜分离物P1与其它PVX分离物CP核苷酸序列同源性最高达97.0%,氨基酸序列同源性最高达100%,证明成功地从大蒜上扩增得到PVX CP基因。而PVX各分离物CP核苷酸序列同源性在75.0~100%之间,CP氨基酸序列同源性在85.5%~100%之间。PVX的系统进化树可划分为两大类型,其中大蒜分离物P1与北京马铃薯和水稻上的PVX分离物亲缘关系最近,表现一定的地域相关性。同时,黑龙江PVX大蒜分离物P1与马铃薯分离物P2核苷酸序列同源性为88.3%,氨基酸序列同源性为99.2%,亲缘关系较近,说明大蒜也是PVX的自然寄主。……   
[关键词]:大蒜;病毒检测;病原鉴定;GCLV;LYSV;PVX;RT-PCR
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:黑龙江八一农垦大学2007年