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电针对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用及机制研究

程井军

   目的随着社会的发展及人民生活水平的不断提高,非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)发病逐渐增多。其病理机制较为复杂,至今尚未完全阐明。其中,游离脂肪酸过多、氧化应激、细胞因子相关性损害等是其重要的病理环节。已有的临床和实验研究表明,脂肪性肝炎与NF-κB、PPAR r的相关性研究文献较少,有必要深入研究,进一步阐明核因子-κB(nuclear factorKappa B NF-κB)、过氧化物酶体增殖物激活受体r(peroxisome prolifera-tor-activated receptor gamma,PPAR r)与NASH之间的关系。NASH尚无理想的治疗药物。中医药在治疗NASH方面具有一定的优势。导师孙国杰教授根据长期临床实践,认为NASH多因长期过食肥甘、体胖少动、七情内伤,致脾失健运,肝失疏泄,痰湿内聚,郁久化热,阴精暗耗,终至形成本虚标实的病理特点。治宜补益肝肾、健脾利湿、化痰逐瘀,穴选肝俞、足三里、丰隆、太冲。我们应用电针刺激患者肝俞、足三里、丰隆、太冲治疗非酒精性脂肪性肝炎,发现电针具有明显的改善非酒精性脂肪性肝炎患者的临床症状、改善肝功能、降低血脂及抗肝纤维化的作用,对非酒精性脂肪性肝炎治疗有较好的临床疗效。本课题采用国内外公认的经典NASH动物模型,结合已有的关于NASH的研究成果,用病理学、生物化学、分子生物学等技术,探讨NASH状态下肝组织NF-κB和PPARrmRNA的表达情况,阐明电针治疗NASH的作用机制,为临床应用电针治疗NASH提供科学依据。 方法将48只SD大鼠称重标记后按随机数字表随机分为2组:正常对照组12只;造模组36只。正常对照组采用普通饲料喂养;造模组采用高脂饲料喂养。实验依据范建高经典造模方法(标准饲料的基础上加2%胆固醇、13%猪油)复制NASH动物模型。12周后,从正常对照组随机抽取2只,造模组随机抽取6只,肝脏病理切片证实造模成功后,取剩余30只造模组大鼠称重,再随机分为模型组10只,电针组10只,药物组10只。正常组不进行电针和药物治疗,同前普通饲料喂养4周;模型对照组,不进行电针和药物治疗,同前高脂饲料喂养4周。针刺组取穴参照新世纪全国高等中医药院校规划教材《实验针灸学》大鼠针灸穴位定位方法及拟人比照法定位,选取双侧肝俞、足三里、丰隆、太冲,自第12周开始每天治疗1次,连续6天后休息1天,共治疗4周;药物组,自第12周开始每天以西药熊去氧胆酸(UDCA)250mg/kg.d的水溶液灌胃,继前高脂饲料喂养4周。各组大鼠在实验第16周隔夜空腹以2%戊巴比妥钠按2ml/kg量麻醉,经下腔静脉采血,迅速按常规分离血清;摘取肝脏。观察动物体重、食欲、行为、状态、毛发及死亡情况,计算肝指数(肝脏湿重/体重×100%);采用Olympus Au560全自动生化分析仪测定血清ALT、AST、TG、TC、FFA、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG);放射免疫分析法测定TNF-α、空腹血清胰岛素(fasting Insulin,FNS;计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR=FBGx FINS)/22.5);肝组织匀浆生化测定MDA、SOD;电泳迁移率改变分析(EMSA)检测NF-KB活性;采用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测PPARrmRNA;将肝组织用4℃生理盐水冲洗,在肝脏最大叶距边缘5mm处取小块肝组织,中性福尔马林固定,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肝组织普通病理变化。另取1mm~3肝组织,2.5%戊二醛及1%锇酸双固定,梯度酒精脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,HITACHI H7500透射电镜下观察肝细胞超微结构变化。 结果 1成功复制大鼠NASH模型。与空白模型组相比,电针组大鼠肝指数明显降低(P<0.05),炎症活动程度皆有明显改善(P<0.05);血清ALT、AST明显降低(P<0.05)。除正常对照组外各组大鼠肝组织均表现有不同程度的脂肪变性、炎症、坏死。电针组肝组织脂肪变性及炎症程度明显减轻,肝组织形态结构改善。 2模型组血清TG、TC、FFA水平比正常组显著增高(P<0.05);模型组比电针组显著增高(P<0.05);电针组血清TG、TC水平较之药物组有下降趋势,但二者比较无明显差异(P>0.05);药物组血清FFA水平较之电针组有下降趋势,但二者比较无明显差异(P>0.05)。 3模型组肝组织MDA含量显著高于正常组(P<0.05),SOD活性显著低于正常组(P<0.05);电针组与模型组比较,MDA含量显著降低(P<0.05),而SOD活性明显升高(P<0.05);电针组与药物组比较,MDA含量有下降趋势,有统4计学差异(P<0.05);而SOD活性有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05)。 4模型组血清TNF-α水平比正常组显著增高(P<0.05);电针组血清TNF-α水平比模型组显著降低(P<0.05);电针组血清TNF-α水平与药物组比较无明显差异(P>0.05)。 5模型组胰岛素抵抗指数水平比正常组显著增高(P<0.05);模型组比电针组增高(P<0.05);电针组与药物组比较无明显差异(P>0.05)。 6模型组和药物组的NF-KB活性明显高于正常对照组(P值均<0.01)和电针组(P值均<0.05)。模型组、电针组和药物组大鼠肝组织PPAR rmRNA的表达均较正常对照组有不同程度的减弱(P值均<0.01),模型组大鼠肝组织PPAR rmRNA的表达明显低于电针组(P<0.01)。 结论氧化应激进而引起脂质过氧化和肝损伤,最终引起前炎症细胞因子产生,启动肝脏炎症反应;在NASH状态下NF-κB活性增强、PPAR rmRNA表达减弱,显示了三者之间的相关性。电针具有多靶位治疗NASH的作用:①电针能明显降低NASH大鼠肝指数,改善肝组织脂肪变性、炎症活动程度及肝功能。②电针能降低血清脂质水平、减轻FFA的肝脏毒性、改善肝脏对脂质代谢的调节、减轻肝脏炎症反应。③电针能够提高肝组织抗氧化能力,减轻脂质过氧化。④电针能降低TNF-α的表达,减少细胞因子相关性损害。⑤电针能改善NASH大鼠IR状态。⑥电针能够抑制NF-KB的活性、促进PPARrmRNA表达。电针治疗NASH的作用可能是通过腧穴-经络-脏腑相关性及神经-内分泌-免疫网络整体调节实现的。……   
[关键词]:电针;非酒精性脂肪性肝炎;大鼠;氧化应激;核转录因子-κB;过氧化物酶体增殖物激活受体r
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:湖北中医学院2007年