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脂多糖致大鼠急性肺损伤模型中部分炎症介质的变化与依达拉奉保护作用及其可能机制的研究

邢海波

   目的 通过观察LPS诱导大鼠急性肺损伤的肺组织病理变化、部分炎症介质和NF-κBp65的表达,了解氧化应激、炎性细胞因子以及NF-κB信号转导通路的活化在急性肺损伤时的变化情况。进一步通过观察依达拉奉干预后急性肺损伤大鼠的肺组织病理、部分炎症介质及NF-κBp65的改变,明确依达拉奉对大鼠急性肺损伤是否具有保护作用以及可能的机制。 方法 健康Wistar雄性大鼠72只,随机分成生理盐水对照组(NS组,n=24)、模型组(LPS组,n=24)、依达拉奉治疗组(ED+LPS组,n=24),各组再分2h,6h和12h三个时间观测点,每组各8只大鼠。生理盐水对照组在相同的时间点注射等量生理盐水,模型组采用尾静脉注射LPS 10mg/kg诱发大鼠ALI模型,依达拉奉治疗组在LPS注射后立即注射依达拉奉3mg/kg。观察各组大鼠一般状态变化,在相应的时间点分别处死大鼠,并留取相应肺组织和血标本。测定大鼠PaO_2和肺组织湿干重比,观察肺组织大体改变,显微镜观察肺组织HE染色病理切片,进行病理评分;测定肺组织匀浆中反映氧化损伤的指标包括MPO、MDA、iNOS和抗氧化指标SOD含量;ELISA法测定血清细胞因子TNF-α和IL-10浓度;免疫组织化学法检测肺组织NF-κBp65的表达情况,并进行半定量分析。 结果 1.一般状态观察:NS组大鼠开始呼吸稍快但很快转为平稳,未见紫绀,活动及饮水基本正常,未见异常排泻物,抓取时迅速逃避;LPS组大鼠在注射LPS后毛发竖起,极少活动,呼吸明显加快,拒绝饮水,排稀水样便,抓取时无力逃避,以6h最为明显并伴有紫绀,有两只大鼠在LPS注射后近6h时因呼吸困难死亡;ED+LPS组大鼠呼吸急促程度较LPS组轻,个别大鼠出现轻微紫绀,大鼠较LPS组活泼,可自行活动及饮水,解少量糊状便,抓取时能够逃避。 2.PaO_2的变化:NS组大鼠PaO_2波动在104.5 mmHg左右;与NS组比较,LPS组大鼠各时间点PaO_2均显著降低(P<0.01),在LPS注射后6 h最低;ED+LPS组各时间点PaO_2均高于LPS组,差异具有统计学意义,但仍低于NS组水平(P<0.01)。 3.肺组织湿干重比变化:NS组大鼠肺组织W/D波动在3.88左右;LPS组在各时间点肺组织W/D与NS组比较均显著增加(P<0.01),在LPS注射后6 h最高;ED+LPS组各时间点肺组织W/D均较LPS组降低(P<0.01),但尚高于NS组水平(P<0.01)。 4.病理变化:大体观察NS组大鼠两肺成均匀的粉白色,表面光滑,无出血灶,无肿胀;光学显微镜见肺泡间隔无增厚,可见少量炎性细胞,肺泡结构完整,肺泡腔清晰;NS组ALI病理评分最低。LPS组两肺出现程度不一的肿胀充血,重者可见散在出血点;光学显微镜可见肺泡间隔明显增厚,炎性细胞浸润和红细胞漏出,重者大片肺泡腔萎陷不张,肺泡腔内有透明膜形成,肺损伤在6 h最严重;LPS组各时间点ALI病理评分均高于NS组(P<0.01)。依达拉奉治疗后使肺损伤病理改变不同程度减轻,ED+LPS组各时间点ALI病理评分较LPS组降低(P<0.01),尚高于NS组(P<0.01)。 5.肺组织匀浆中反映氧化损伤的指标和抗氧化指标的变化:LPS组大鼠肺组织匀浆中MPO、MDA和iNOS含量同NS组比较各时间点均升高(P<0.01),在6 h时达高峰,而肺组织匀浆中SOD含量各时间点均低于NS组(P<0.01);依达拉奉治疗后大鼠肺组织匀浆内MPO、MDA和iNOS含量均较LPS组降低(P<0.01),但仍高于NS组(P<0.01),同时依达拉奉治疗后大鼠肺组织匀浆内SOD活性较LPS组升高(P<0.01),但低于NS组(P<0.01)。 6.血清炎性细胞因子的变化:与NS组比较,LPS组各时间点大鼠血清TNF-α浓度升高(P<0.01),2 h达高峰,随时间推移而降低,12h仍高于NS组;依达拉奉治疗后大鼠血清TNF-α浓度较LPS组明显降低(P<0.01),但仍高于NS组(P<0.01)。LPS组各时间点大鼠血清IL-10含量均高于NS组(P<0.01),随时间推移呈上升趋势;ED+LPS组血清IL-10浓度同LPS组比较无明显变化,各时间点均高于NS组(P<0.01)。 7.NF-κBp65表达:NS组可见少量散在的NF-κBp65阳性免疫反应产物,主要位于胞浆中。LPS组可见较多NF-κBp65阳性免疫反应产物,随着LPS刺激时间的不同而变化,在6h时最明显,NF-κBp65阳性免疫反应产物主要位于细胞核中,表明NF-κB被激活;各时间点NF-κB p65的IOD同NS组比较均升高(P<0.01)。ED+LPS组NF-κB p65阳性免疫反应产物也主要位于细胞核,但表达强度较LPS组降低;各时间点NF-κB p65的IOD较LPS组降低(P<0.01),但仍高于NS组(P<0.01),表明经依达拉奉处理后,LPS诱导增加的大鼠肺组织NF-κB表达受到抑制。 结论 1.通过静脉注射LPS可以成功复制大鼠ALI模型。 2.LPS注射后导致大鼠肺组织内反映氧化损伤的指标MPO、MDA和iNOS升高,抗氧化指标SOD降低;血清促炎细胞因子TNF-α升高和抗炎细胞因子IL-10早期相对不足。LPS应用后还导致肺组织NF-κB信号转导通路活化。 3.依达拉奉对ALI具有保护作用。其机制是依达拉奉能清除自由基,抑制NF-κB活化,从而一方面抑制肺内炎性细胞的聚集和氧化应激,降低肺组织MPO、MDA和iNOS含量,增加肺组织SOD活性;另一方面还可以抑制LPS诱导的促炎性细胞因子TNF-α释放,而不影响抗炎性细胞因子IL-10水平。……