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构建携带IGF-1和GFP基因的柞蚕核型多角体病毒双启动子转移载体

何杨

   胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factors,简称IGFs),又称类胰岛素样生长因子,是一类多功能细胞增殖调控因子。该家族中的胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor-1,IGF-1)是一种由70个氨基酸组成的分子量为7650Da的单链、肽类生长因子,具有广泛的生物学功能,对动物生长和消化道的发育具有重要作用,其研究前景非常广阔,但其天然含量少且提取困难,故市售价格昂贵。因此,希望将IGF-1运用昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system,简称BEVS)在柞蚕蛹中进行表达,将蛹直接粉碎即可作为饲料添加剂使用。 本研究的目的是构建带有IGF-1基因和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,简称GFP)基因的柞蚕核型多角体病毒双启动子转移载体。本实验首先根据苜蓿银纹夜蛾和家蚕的核型多角体病毒IE-1基因上游序列,设计同源引物,克隆了柞蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子片段,并与最近登陆在Gene Bank的同源序列比对,结果显示同源性极高,与家蚕和斜纹夜蛾多角体病毒的IE-1启动子相比,具有早期基因启动子特点。将IE-1基因启动子插入到质粒pGFP-N2的GFP基因上游,构建了IE-1/pGFP-N2表达载体。通过转染Hela细胞,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,证明克隆的启动子具有转录活性,表达载体构建成功。IE-1基因启动子是杆状病毒的极早期基因启动子,侵入细胞后就会迅速激活下游基因表达,有利于快速简便的筛选重组病毒。 其次,选取SV40 polyA作为IGF-1的终止序列,通过PCR对其扩增并构建了它的克隆载体pMD-SV40 polyA;以IE-1/pGFP-N2为模版,扩增带有IE-1基因启动子的GFP,使扩增的Pie-GFP两端带有EcoRⅠ酶切位点,构建出pMD-Pie-GFP克隆载体。因为IGF-1为小分子肽类活性物质,为了提高它的表达量,构建了IGF-1串联拷贝数分别为一至四的多拷贝克隆载体pUC-IGF-1(1-4)-SV40 polyA,本实验利用BamHⅠ和BglⅡ是同尾酶,它们作用酶切位点后产生相同的粘性末端序列,并且连接后酶切位点消失的原理,逐步插入IGF-1得到多拷贝克隆载体。 最后,以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切IGF-1拷贝数分别为一至四的克隆载体,以EcoRⅠ酶切pMD-Pie-GFP,回收IGF-1(1-4)-SV40 polyA和Pie-GFP,将这两段基因插到已有的柞蚕核型多角体病毒转移载体pApM的多克隆位点上,其中IGF-1在pApM的多角体基因启动子下游,Pie-GFP在IGF-1之后,构建出带有IGF-1基因和GFP基因的柞蚕核型多角体病毒双启动子转移载体。PCR法筛选出Pie-GFP插入方向正确的双启动子转移载体,该转移载体的突出特点是在筛选重组病毒时,有重组病毒的细胞在荧光显微镜下呈绿色,具有明显的选择标记,使筛选工作简化。……   
[关键词]:杆状病毒;IGF-1;双启动子;转移载体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:大连理工大学2007年