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BCL10介导LPS/TLR4信号通路的机制研究

董伟

   先天免疫又称固有免疫或天然免疫,是机体防御病原体的第一道防线。在先天免疫系统中,不同吞噬细胞如嗜中性粒细胞和树突细胞等通过来自Toll样受体(TLR)的信号而辨别出病原体及“自己”。在启动先天免疫对抗病原体的过程中最重要的一步就是识别,由杀伤细胞的受体识别存在于病原体而不存在于细胞中的成分,这称为病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)。不同的TLR识别的PAMP不同,例如TLR4可以识别革兰氏阴性菌的LPS。在这里,我们证明T细胞和IκB激酶复合体间的重要信号分子BCL10与先天免疫系统有关,并参与了TLR4途径及核因子κB(NF-κB)的激活。 BCL10作为一个在适应性免疫信号转导中的信号分子,其在TCR通路中的作用机制已经得到了很好的说明,我们的工作发现,BCL10不仅在适应性免疫中具有信号转导功能,而且在先天免疫中也有这种作用,它能在细菌LPS刺激下,参与LPS/TLR4途径,最后引起NF-κB的活化,我们还提出了这条通路中针对BCL10的负反馈调节模型。在这里,我们对其作用机制进行了研究,发现在LPS刺激下,TLR4途径中的上游信号分子IRAK1对BCL10有招募作用,能结合BCL10到TLR4复合物中。我们构建了IRAK1表达沉默的细胞系,当细胞中IRAK1的表达被沉默时,BCL10不会被招募到TLR4复合物中。我们构建了IRAK1激酶活性失活的突变体,检测到它依然能招募BCL10到TLR4复合物中,说明这种作用并不依赖于其激酶活性。BCL10被招募后,可以传递IRAK1发出的信号,使NF-κB活化。当LPS刺激时,IRAK1发生寡聚化是其活化的主要原因,IRAK1的寡聚化能导致BCL10的寡聚化,使BCL10活化。我们还对IRAK1和BCL10的作用序列进行了定位,将IRAK1和BCL10进行截短突变,再通过pull-down实验来验证相互作用,发现IRAK1的514-543位氨基酸残基是与BCL10结合的功能区。 Pellino蛋白作为一个新的信号传导分子在TLR信号亚通路的建立和维持中发挥着重要的作用。近期研究表明外源鼠pellino2反意(antisense)重组表达能抑制LPS诱导的NF-κB的活化。在LPS刺激的巨噬细胞中,BCL10同Pellino2在体内能相互作用。我们通过siRNA重组质粒pSUPER-Pellino2构建了Pellino2表达沉默的细胞系。在该细胞系中,我们发现LPS诱导或BCL10过表达所引起的NF-κB的激活均受到部分抑制,说明Pellino2在介导LPS通路或BCL10所参与的信号转导中发挥着重要作用。我们用siRNA质粒pSUPER-BCL10转染构建了BCL10表达沉默的细胞系,发现受LPS刺激后BCL10表达的沉默会削弱NF-κB的活化。而在野生型和BCL10表达沉默型细胞中,TNF-α处理引起的NF-κB活化情况没有差异。这就提供了一种可能即BCL10是TLR4下游的特殊信号分子。在随后的实验中,当LPS刺激后,内源性TLR4能与BCL10共沉淀下来,暗示BCL10参与了TLR4通路并被招募到了TLR4的信号复合物中;此外在Pellino2沉默型的RAW264.7细胞中,BCL10的招募没有受到影响,说明Pellino2是LPS通路中位于BCL10下游的一个接头分子。 SOCS3在LPS/TLR4通路中起着负反馈调节作用。为了确定SOCS3在LPS通路中的确切功能以及BCL10是不是SOCS3作用靶标,我们用免疫沉淀来检测体内BCL10与SOCS3的结合。在用LPS刺激的或没有刺激的细胞中,过表达的SOCS3都能与BCL10相互作用。为了进一步确证,我们构建了能稳定表达SOCS的细胞系,发现SOCS3的过表达能减弱BCL10诱导的NF-κB活化。因此,BCL10可能是LPS通路中SOCS3的负调控的靶标分子。另外,在相同的细胞系中,我们发现当SOCS3过表达时,同野生型的细胞系相比,BCL10与Pellino2之间的相互作用明显减弱,BCL10与SOCS3的相互作用显著增加。而在SOCS3免疫沉淀的复合物中没有发现Pellino2,在Pellino2免疫沉淀的复合物中也没有找到SOCS3,说明SOCS3与Pellino2并没有相互作用。因此, SOCS3对LPS/TLR4的负调控可能是通过与BCL10的相互作用来减少BCL10与Pellino2的相互作用而实现的。 在TCR通路中,MALT1是位于BCL10下游重要的信号蛋白,负责传递由BCL10到TRAF6的信号,最终引起NF-κB的活化。最近有人发现在BCL10的结构中有一段16个氨基酸残基的序列负责与MALT1的结合。我们通过RNAi技术对MALT1的表达沉默,发现在RAW264.7细胞中由LPS引起的NF-κB的活化显著减弱,说明MALT1参与了LPS/TLR4信号通路。我们的结果还证明MALT1可以和BCL10和TRAF6作用,并促进TRAF6在细胞质中的自身泛素化。同时我们检测到MALT1可以与BCL10和TRAF6作用,但它只出现在细胞质的信号复合物中,而后两者还出现在膜相关复合物中,说明MALT1使它们由细胞膜信号复合物转移到细胞质信号复合物中。由于BCL10与TRAF6不存在直接相互作用,我们发现信号分子Pellino2充当了桥梁作用,当IRAK1降解后促进了BCL10和IRAK1之间的解离,介导了BCL10与TRAF6的作用同。……   
[关键词]:IRAK-1;BCL10;Pellino2;LPS;TLR4;NF-κB;MALT1
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:武汉大学2006年