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柑橘衰退病毒的血清学特性分析及其诱导寄主差异表达基因的筛选

王彩霞

   柑橘在世界果品产业中占有重要的经济地位。由柑橘衰退病毒(Ctirus tristezavirus,CTV)引起的衰退病是影响全球柑橘生产的重要病害之一。目前,许多国家防治该病毒采取的措施是种植无病毒苗木和利用弱毒株系的交叉保护作用及对调运种苗实施检疫。这些环节均需对病毒进行检测,血清学方法以其灵敏度高、快速、经济及适合大规模样品检测等优点而被广泛应用于果树病毒的检测中。已有研究表明,CTV具有明显的株系分化,株系间存在致病性的差异,但有关该病毒与寄主互作特性的研究尚很缺乏。 本研究通过改进CTV的提纯方法,制备针对我国发生CTV的多克隆和单克隆抗体,并对其检测效果进行分析;以柑橘离体培养植株为研究体系,分析了CTV对离体培养柑橘的形态建成和生长发育及基因表达的影响,旨在为建立高通量、快速的病毒检测技术提供有效的检测试剂,为进一步深入研究我国CTV的株系特点、筛选具有我国区域特点的CTV弱毒株系和探究该病毒与寄主互作关系并筛选有效的抗病毒基因等奠定基础。取得的主要研究结果如下: 1.以田间表现茎陷点症状的甜橙(Citrus sinensis)L5和S4为材料,利用改进的提纯方法获得了CTV的提纯液,其产量为1 mg/100 g植物组织。用CTV免疫大耳白兔,获得多克隆抗体,间接ELISA效价为1∶25 600。用CTV免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、ELISA筛选和克隆化培养,获得18株能稳定分泌抗CTV单克隆抗体的杂交瘤单细胞株,腹水抗体的间接ELISA效价为1∶12 800~1∶204 800。对其中任意4株单克隆抗体进行分析的结果表明,这些抗体的抗原识别位点存在差异,其中2G和3H的抗体类型及亚类为IgG2a,1E和4H为IgG2b。用所制备抗体对不同来源柑橘样品的CTV检测结果显示,单克隆和多克隆抗体结合使用,采用三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)法可以获得理想的检测效果,其特异性强、灵敏度高。同时发现所分析4株单克隆抗体对不同的CTV分离物鉴别能力存在差异,但有关这些CTV分离物的特性及其血清学关系还需进一步研究。 2.利用3种不同来源的CTV抗体(PAb-I、PAb-L5和MAbs-S4)对田间柑橘样品进行检测时,筛选到一个表现特异血清学性状的分离物HB1,此分离物仅能被PAb-L5所识别,而与PAb-I和MAbs-S4均不发生免疫反应。为了明确该分离物的血清学特性与其生物学性状的关系并进一步揭示血清学差异的分子机制,对CTV-HB1、CTV-L5和CTV-S4的生物学性状进行了观察,并对其CP基因的RFLP组群和序列进行了分析。结果显示,3个CTV分离物均在墨西哥来檬(C.aurantifolia)和甜橙(C.sinensis)上产生典型的茎陷点症状;CTV-HB1的CP基因表现出单一的CP/Hinf I RFLP谱型,同CTV-L5的CP/Hinf I RFLP谱型一致,但与CTV-S4的CP/Hinf I RFLP谱型存在较大差别。序列分析结果表明,CTV-HB1 CP基因的氨基酸序列与CTV-L5、SY568和NUagA的氨基酸序列相似性均在97%以上。此外,CTV-HB1与CTV-L5 CP基因的氨基酸序列间仅有3个位点[84(S→L)、98(G→D)和190(G→C)]的变异,而此3个氨基酸位点在其它已报道的CTV分离物中都是保守的。利用蛋白质分析软件对4个CTV分离物(HB1、L5、S4和0002)CP基因的抗原指标及可能的抗原表位进行推测的结果表明,CTV-HB1仅在84和190氨基酸位点处有小的吸收峰,而在CTV-HB1和CTV-L5 CP基因的5′末端存在一相似的吸收峰,因此推测5′末端结构的差异可能是造成CTV-HB1不能被PAb-I和MAbs-S4识别的直接原因。以上结果暗示了CTV分离物的不同血清学特性,可以为揭示CP基因上的不同抗原决定簇及寻找新的株系特异性结合位点等提供新的依据。 3.建立了幼年态墨西哥来檬、甜橙和香橼(C.medica),及成年态鱼橙的离体快繁体系,并筛选出成年态GL橙、AW橙和霜橙茎段初代培养的适宜培养基。对感染CTV柑橘及其健康对照进行离体培养,结果显示CTV的侵染可以显著影响离体培养柑橘的生长发育和形态建成,除降低其腋芽萌发率、个数及高度外,还显著降低了离体植株的生根能力。在幼年态柑橘中,病毒侵染对香橼的影响最为严重,墨西哥来檬居中,而对甜橙的影响相对较小;在成年态柑橘中,CTV侵染对霜橙的影响最为严重。利用TAS-ELISA和免疫捕捉(IC-)RT-PCR及试管嫁接等方法,对不同培养时期离体植株中CTV效价和嫁接传染力的变化动态进行了分析,结果显示,病毒的效价和嫁接传染力同离体植株的生长势存在一定的相关性,在前三次的继代培养过程中,CTV的效价和嫁接传染力均未发生明显变化,但继代培养15次后,墨西哥来檬和甜橙离体植株中病毒的效价和嫁接传染力均显著降低,香橼离体植株中病毒的效价甚至在继代培养6次后就显著下降。以上研究结果表明,不同柑橘品种对CTV的敏感程度存在差异,并且暗示了病毒的侵染诱导或抑制了寄主中某些跟生长发育或抗性有关基因的表达。 4.以墨西哥来檬离体植株为研究体系,利用抑制差减杂交技术(SSH)构建了CTV诱导寄主上调和下调表达文库。通过反向Northern斑点杂交技术对两个差减文库进行筛选,共获得了203个差异表达片段。经过DNA测序并在已知的核酸与蛋白质数据库中比对分析,发现两个文库中共有180个unigene差异表达,其中CTV诱导寄主上调表达的基因80个,下调表达的基因100个。本研究在墨西哥来檬中分离鉴定出的180个ESTs片段,目前在柑橘中报道的仅有17个,其它绝大部分来源于拟南芥、烟草和番茄等。在180个ESTs片段中,50%尚不能推断其功能,其余50%涉及抗病防御、转录、信号转导、能量、代谢、蛋白质合成等信号途径,提示CTV与寄主互作是一个复杂的多基因参与的过程。本研究首次报道了CTV诱导寄主差异表达的180个ESTs,研究结果对认识病毒-寄主互作的分子机制有理论与实践意义。……   
[关键词]:柑橘;柑橘衰退病毒;多克隆和单克隆抗体;外壳蛋白;茎段培养;形态建成;抑制差减杂交;基因筛选
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2007年