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猪O型口蹄疫病毒及猪传染性胸膜肺炎放线菌毒素抗原表位研究

何玉龙

   口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)和传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是严重危害养猪业的传染病。本研究对口蹄疫病毒和传染性胸膜肺炎抗原表位进行了进一步研究。 1.口蹄疫结构蛋白和非结构蛋白3ABC抗原表位的研究 联合运用4种参数、3种方法对O型口蹄疫病毒O/ES/2001株抗原表位进行了预测。预测结果显示,O型FMDV3种主要结构蛋白均存在较多潜在B细胞表位,虽然VP2、VP3、VP4三种结构蛋白潜在的表位不易暴露在FMDV粒子表面。 以纯化的口蹄疫全病毒抗体、非结构蛋白3ABC抗体为靶分子,采用抗原竞争洗脱和同步液相反向吸附的方法,对噬菌体展示12肽库进行了4轮亲和筛选。结果,在用FMDV以P1蛋白竞争洗脱得到的13噬菌体克隆存在VXLPK核心基序;用VP1蛋白竞争洗脱得到的12个噬菌体克隆存在VFLPK和KPXEP两个基序;用3ABC洗脱得到的噬菌体克隆存在LSFPS基序,推断核心序列为相应蛋白质的模拟表位或构象表位。得到的结构蛋白VP1上的7个线性抗原表位序列,分别位于42-46、136-144、141-150、144-149、148-158、150-158、199-208位,其中的一些位点互相重叠,但具有不同的骨架氨基酸残基,为单独的抗原表位。核心序列KPXEP与VP1蛋白的43-47位具有较高的同源性,再次证实了该线性表位的存在,进一步明确了FMDVO/ES/2001株的该位点的抗原表位氨基酸残基为Lys-Pro-Glu,这一点与其它毒株有所不同。在本试验得到的7个展示序列中,除克隆VP1-5外,其它克隆展示肽段均含有与VP1蛋白氨基酸序列208位氨基酸残基相同的(Pro),因此认为,208位Pro可能在空间构象上参与上述各表位的构成。此外得到了VP2的8个线性抗原表位序列,位于其氨基酸序列的3-7、29-32、72-77、80-84、127-129、131-139、207-212、213-215位;VP3的3个线性抗原表位序列29-36、33-38、131-138位和VP4的1个线性抗原表序列6-8位,以及位于非结构蛋白3ABC上1-5、4-8、153-156、176-179、399-402、420-423位的6个线性抗原表序列。以上序列均在预测结果显示的较高抗原指数区域。 根据筛选到的噬菌体阳性克隆,分9组免疫昆明小鼠,每组6只,以噬菌体原始肽库为阴性对照、口蹄疫病毒灭活苗为阳性对照。共免疫3次。第3次免疫后测定IgG1/IgG2a值,以确定免疫反应类型。结果在第2次免疫后,部分小鼠血清中产生一定滴度的抗体,9组阳性率分别为33.33%,33.33%,16.67%16.67%,20.00%,33.33%,50.00%,50.00%,0.00%(阴性对照组),3次免疫后,阳性率分别为83.33%,83.33%,66.67%,83.33%,100.00%,83.33%,83.33%,100.00%,0.00%(阴性对照组)。显示携带口蹄疫病毒结构蛋白抗原表位的噬菌体克隆具有一定的免疫原性。对诱导小鼠产生的IgG亚型进行鉴定,结果表明噬菌体抗原在小鼠体内以激活辅助性T细胞Th1为主,进而诱导B细胞产生高滴度的IgG2a,实现对机体的保护。用携带非结构蛋白3ABC抗原表位的噬菌体克隆对疑似感染野生型口蹄疫病毒的22分猪血清进行检测,与鉴别诊断试剂盒对比,符合率最高达86.36%。 2.猪传染性胸膜肺炎放线菌3种主要外毒素抗原表位的研究 猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病。运用生物信息学手段对APP4种主要外毒素(ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ)抗原表位进行预测,结果表明,4种毒素蛋白均存在较多的潜在的B细胞抗原表位,ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ蛋白B细胞表位主要在420位氨基酸残基之后的C端。ApxⅣ潜在B细胞表位均匀密集地分布在整个蛋白序列各区。以纯化猪APP3种外毒素(ApxⅠ、ApxⅡ与ApxⅢ)的IgG为固相靶分子对噬菌体展示12肽库进行筛选,经4轮筛选,选取5个有较强结合能力且无交叉反应的噬菌体克隆提取ssDNA测序,经多序列比对发现,用ApxⅠ洗脱得到的噬菌体克隆展示肽核心基序RVDV,用ApxⅢ洗脱得到的噬菌体克隆展示肽核心基序DMLXXXR、DML、SXXXRPXA。与相应蛋白质序列比对,综合预测结果,得到了ApxⅠ上可能存在表位分别位于ApxⅠ蛋白序列的196-199、129-132、694-696、475-478、687-692位,ApxⅡ上可能存在的表位分别位于938-943、541-544、819-821、316-319位,ApxⅢ的58-60、110-112、240-243、682-684、777-780、806-808、840-843、901-905、959-962段上可能存在的9个表位,这些位点均在预测结果范围内。 分别用一种毒素筛选到的展示肽与另外两种毒素筛选到的展示肽序列比对,发现6个噬菌体克隆可能展示3种毒素两两交叉存在的B细胞表位,ApxⅠ和ApxⅡ的共同表位序列Thr-Trp-Thr-Val、Arg-Val-Asp和Leu-Thr-Phe,ApxⅠ与ApxⅢ的共同表位序列Leu-Thr-Glu-Arg和Pm-Ser-Thr/Ser,ApxⅡ与ApxⅢ的共同表位序列Ala-Leu-Ser。据此认为筛选到了携带ApxⅠ与ApxⅡ、ApxⅠ与ApxⅢ、ApxⅡ与ApxⅢ可能共有的抗原表位。 用筛选到的噬菌体阳性克隆与亚单位苗分别免疫昆明小鼠发现,在加强免疫后,小鼠均可产生不同滴度的抗体。经对IgG进行亚类鉴定结果,血清中IgG1/IgG2a>4。……   
[关键词]:口蹄疫病毒;猪传染性胸膜肺炎放线菌;毒素;抗原表位
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2007年