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东方巴贝斯虫cDNA文库构建及其应用

刘琴

   东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是一种经镰形扇头蜱传播的重要血液原虫,是由本实验室发现和命名的一个巴贝斯虫新种,主要引起水牛巴贝斯虫病。该病在我国长江以南许多省份发生和流行,临床上患病牛以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为特征,甚至引起死亡,造成重大的经济损失。 本研究首先进行了B.orientalis的分子分类学研究,在此基础上建立了B.orientalis的半巢式PCR诊断方法,然后构建了B.orientalis cDNA文库,以该文库为基础,进行了B.orientalis EST序列的测定和分析,并进一步克隆和原核表达了东方巴贝斯虫热休克蛋白70(HSP70)基因。 (1) B.orientalis分子分类学研究 利用真核生物18S rRNA通用引物扩增了B.orientalis 18S rRNA基因。测序后BLAST分析表明该虫种属巴贝斯虫。将该基因1,700bp长片段序列与GenBank中15种已知巴贝斯虫的相应序列进行比较分析,建立系统发育树。结果表明,B.orientalis与南非未定种的巴贝斯虫亲缘关系最近,与羊巴贝斯虫亲缘关系较近,与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的亲缘关系较远。这一结果从分子生物学上进一步证实了东方巴贝斯虫是一独立种。 (2) B.orientalis半巢式PCR诊断方法的建立与应用 根据B.orientalis 18S rRNA基因V_4多变区设计引物,建立了检测B.orientalis的半巢式PCR(semi-nested PCR),特异性扩增B.orientalis 18S rRNA基因257bp的片段,敏感性试验表明其敏感性达到0.00000012%。运用建立好的半巢式PCR与传统的姬姆萨染色显微镜检的方法对湖北长江以南4个巴贝斯虫病疫区121份水牛血样,385份镰形扇头蜱样品及湖北长江以北3个巴贝斯虫病非疫区71份水牛血样进行了检测,检测结果为:湖北长江以南4个疫区,血液样品镜检5份阳性,半巢式PCR 24份阳性,蜱的样品半巢式PCR 35份阳性;湖北长江以北3个非疫区镜检梨形虫17份阳性,半巢式PCR未检测到阳性样品。针对上述检测结果,利用18S rRNA通用引物扩增非疫区的17份阳性模板,测序后分析均为泰勒虫。实验结果表明:本试验建立的B.orientalis半巢式PCR检测方法具有很高的特异性和敏感度,是一个快速有效的检测方法。从流行病学调查的结果显示:B.orientalis在湖北长江以南广泛分布,流行严重。 (3) B.orientalis cDNA文库的构建 利用E.Z.N.A~(TM) Blood RNA Kit提取纯化的红细胞期B.orientalis的总RNA,利用SMART~(TM) cDNA Library Construction Kit反转录合成cDNA第一链,LD-PCR扩增长片段cDNA,连接λTriplEx2噬菌体载体,利用Gigapack~(?)ⅢGold Packaging Kit体外包装,构建了B.orientalis cDNA文库。对原初文库及扩增文库的质量和滴度的监测表明:文库的插入片段在0.5~3.0kb之间,蓝白斑实验表明其重组率约98.8%,原初文库的滴度为2.0×10~6pfu/mL,扩增文库的滴度为5.8×10~8pfu/mL。结果表明:成功的构建了B.orientalis cDNA文库。利用制备的抗B.orientalis兔血清对构建好的B.orientalis cDNA文库进行免疫学筛选,筛选到3个强阳性克隆子。测序后BLAST分析分别为:B.orientalis热休克蛋白70(HSP70)基因,核动蛋白(nuclear movement protein)基因及功能未知的假定蛋白(hypothetical protein)基因。 (4) B.orientalis EST序列的测定及分析 从B.orientalis cDNA文库中随机挑取噬菌斑,转染BW25.8,经PCR鉴定后送插入片段大于300bp的阳性克隆子测序,共测定了324条B.orientalis EST序列,对有效EST序列运用phrap等软件进行拼接,聚类后BLAST分析,得到46个同源性较高的unigene,这些基因分别为:类红细胞表面抗原、类裂殖体表面抗原、代谢相关的磷酸酶及蛋白酶、核糖体蛋白、热休克蛋白70、类热休克蛋白90、肌动蛋白、锌指蛋白等基因的部分或全基因及功能未知的假定蛋白(hypothetical protein)基因部分或全基因。 (5) B.orientalis HSP70基因的克隆与原核表达 根据EST测序的结果,设计一对特异性扩增B.orientalis HSP70基因开放性读码框(ORF)的引物,克隆了B.orientalis HSP70的ORF全长基因,构建原核表达质粒pGEX-KG-HSP70,在E.coli BL21-CodonPlus中实现了高效表达,表达产物经Western-blot检测分析,结果表明原核表达的HSP70具有较强的免疫反应原性。 本研究对B.orientalis的分子分类学研究,从分子水平证实了B.orientalis是一独立的新种。建立的半巢式PCR诊断方法,解决了目前水牛巴贝斯虫病不易准确诊断的难题,对水牛巴贝斯虫病的临床诊断、流行病学调查等具有重要意义。本研究构建的B.orientalis的cDNA文库、EST序列的测定以及HSP70基因的克隆和原核表达为进一步进行B.orientalis分子生物学的研究,获得免疫原性基因和其他基因信息以及水牛巴贝斯虫病的免疫预防、致病机制等研究奠定良好的基础。……   
[关键词]:东方巴贝斯虫;18S rRNA;半巢式PCR;cDNA文库;免疫学筛选;EST;HSP70基因
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2007年