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siRNAs抑制猪圆环病毒复制的研究

孙敏轩

   猪圆环病毒属圆环病毒科,是一种小型、无囊膜,单链DNA病毒。该病毒有两种基因型,即圆环病毒1型(PCV1)和圆环病毒2型(PCV2)。研究发现PCV1和PCV2在全球范围内广泛流行。虽然一直以来都没有证据证明PCV1致病,但是其潜在的危险不容忽视,尤其是猪作为各类器官移植供体的时候。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)、猪皮炎和肾病综合症(PDNS)、先天性震颤、早产、渗出性皮炎等重大传染病的“罪魁祸首”。尽管PCV感染给养猪业带来了重大灾难,但是目前还缺乏有效的疫苗来防治。RNAi是siRNA介导的转录后抑制机制,为人们预防和治疗病毒感染开启了希望之门。本研究以PCV1和PCV2的复制蛋白Rep为靶基因,我们构建了3个针对PCV1和PCV2共同靶序列三个的siRNAs表达质粒(pS-RepA,pS-RepB,pS-RepC),并在细胞水平上研究它们对PCV1和PCV2的复制的抑制作用。 1.siRNAs对PCV2 Rep基因表达的抑制 本研究构建了Rep基因与EGFP融合的真核表达质粒(pCDRep-EGFP),并分别与pS-RepA,pS-RepB和pS-RepC 3个siRNAs表达质粒共转染PK-15细胞。经荧光观察、流式细胞仪检测、Western blot、RT-PCR等方法证实:pS-RepA,pS-RepB,pS-RepC对PCV2 Rep基因表达都有显著的特异性抑制作用,其中pS-RepA和pS-RepB抑制效果达到20%—50%,而pS-RepC抑制效果最佳为84.5%。 2.siRNAs对PCV1和PCV2复制的抑制 将上述构建的3个siRNAs表达质粒分别转染PK-15细胞,24小时后感染PCV1或PCV2病毒,经Real-time PCR、Western blot、TCID_(50)等方法证实:在3个siRNAs序列中pS-RepA,pS-RepB,pS-RepC对PCV1和PCV2的复制都有特异性抑制作用,其中pS-RepC对PCV1和PCV2的复制及结构蛋白的表达均具有显著的抑制能力。本研究表明:针对PCV1和PCV2 Rep蛋白共同靶序列的siRNAs可以实现对二者复制的共同抑制,RNAi可以作为一种新的、具有应用潜力的方法应对PCV感染,而pS-RepC则可以作为一种有效的siRNAs序列。……   
[关键词]:圆环病毒;RNA干扰;siRNA;Rep基因;Cap基因
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2007年