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猪轮状病毒培养感染研究与间接夹心ELISA诊断方法的建立

徐璐

   猪轮状病毒(Porcine Rotavirus)是危害养猪业的主要病毒性腹泻病原之一,本研究以猪轮状病毒OSU株为材料,对轮状病毒的细胞培养关键技术、病毒感染仔猪的症状和病变进行了研究,并建立了检测猪轮状病毒的间接夹心ELISA方法。 本研究确立了猪轮状病毒最佳培养条件,并进行了病毒人工感染试验。病毒经20μg/mL胰酶处理1h,接种细胞于37℃吸附2h,用含4μg/mL胰酶的维持液(MEM)培养,连续传至10代细胞出现葡萄串状堆积、胞浆相连、拉网等病变。透射电镜观察到病毒粒子呈圆形车轮状,直径约为80nm。病毒口服感染3日龄未食初乳仔猪,于感染后10h出现腹泻,粪便呈黄色水样混有白色絮状物,接种后42h死亡。剖检可见胃内有凝乳块,肠壁变薄充满液体,盲肠、结肠充气。主要病理变化:肠腔内积有多量脱落的上皮细胞和炎性渗出物,其中混有红细胞;肠上皮细胞变性、坏死、脱落;固有膜毛细血管高度扩张、充血,并伴有轻微出血;严重者粘膜上皮大量脱落,裸露出固有膜;粘膜下层水肿、增厚,炎性细胞浸润。 建立了检测猪轮状病毒抗原的间接夹心ELISA。采用超速离心从病毒细胞培养物提纯病毒分别免疫猪和兔,制备的高免血清用硫酸铵沉淀法粗提IgG,再分别通过羟基磷灰石及阴离子交换层析,得到纯化的猪抗RV IgG和兔抗RV IgG,建立检测猪轮状病毒的间接夹心ELISA。试验确定了ELISA最佳工作条件:猪抗RV IgG包被浓度为4μg/mL,4℃包被过夜;封闭液为1%牛血清白蛋白(BSA),37℃封闭60min;抗原孵育条件为37℃90min;兔抗RV IgG浓度为3.5μg/mL,37℃孵育90min;酶标羊抗兔抗体浓度为1:8000,37℃孵育90min;底物作用时间为15min。阴阳性结果判定的临界OD值为0.161。重复性试验表明该方法重复性较好。间接夹心ELISA不与猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪细小病毒、乙脑病毒、大肠杆菌、猪传染性胸膜肺炎杆菌呈现交叉反应,特异性好。敏感性试验测定最低抗原检出量为1.25μg/mL。包被的酶标板在-20℃、4℃和常温中,至少可以保存4周。 本研究确立了猪轮状病毒最佳培养条件,复制出该病毒感染仔猪的急性病例,建立了间接夹心ELISA诊断方法,为该病的快速准确诊断和深入开展病原学研究奠定了基础。……   
[关键词]:猪轮状病毒;细胞培养;病毒感染;间接夹心ELISA;检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2007年