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OP模鼠MSCs生物学特性及药物对大鼠MSCs骨向分化的干预研究

杨丽

   目的:通过比较正常与去卵巢骨质疏松(Osteoporosis,OP)大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的生物学特性,探讨去卵巢对大鼠MSCs的影响;研究骨碎补及淫羊藿水提液、淫羊藿苷及柚皮苷、益骨胶囊含药血清及细胞因子转化生长因子β_1(Transforming growth factor-betal,TGF-β_1)、骨形成蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对MSCs增殖和骨向分化能力的影响,并观察确有防治OP疗效的单味中药、中药单体、中药复方对Smads蛋白通路中上游细胞因子TGF-β_1、BMP-2的影响,分析它们可能的作用途径,为阐释其防治OP的作用机理提供实验依据,并为以TGF-β_1、BMP-2作为平台筛选防治OP药物提供可行性实验探索。 方法: 1.运用全骨髓贴壁法分离培养MSCs; 2.通过形态学、流式细胞仪检测表面标志物及多向分化能力鉴定MSCs; 3.选用10月龄Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠双侧卵巢切除增龄3月法复制OP模型; 4.通过比较正常与OP大鼠MSCs形态学、生长曲线、生长周期及骨向、脂向软骨向分化能力探讨去卵巢对大鼠MSCs的影响; 5.运用MTT法检测不同浓度各干预药物对大鼠MSCs增殖的影响,以确定其最佳促增殖剂量; 6.以碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)确定各干预药物不同浓度梯度中最佳促MSCs骨向分化剂量; 7.实验分为空白组、经典组(10~(-8)地塞米松+10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50μmol/L维生素C)、药物组(药物最佳诱导骨向分化剂量)和药物+经典组(药物最佳诱导骨向分化剂量+10~(-8)M地塞米松+10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50μmol/L维生素C),通过检测诱导分化过程中ALP、Ⅰ型胶原(TypeⅠcollagen,ColⅠ)、骨钙素(Bone gla protein,BGP)和钙化结节等指标的表达,来观察其对MSCs骨向分化能力的影响; 8.ELISA法检测各药物骨向分化过程中TGF-β_1、BMP-2的表达,阐释其促MSCs骨向分化可能的作用机制; 9.Real-time PCR法检测rhBMP-2、rhTGF-β_1对Smad4及其下游细胞因子Cbfα1 mRNA,进一步阐释各药物诱导MSCs骨向分化可能的作用机制。 结果: 1.流式细胞仪检测大鼠MSCs表面标志抗原CD44、CD29表达阳性,CD45及CD34表达阴性,MSCs能成功诱导为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞; 2.与正常组相比,OP大鼠MSCs体外增殖能力下降,其骨向分化能力及对成骨诱导剂反应力降低,脂向分化能力及对成脂诱导剂反应力增强,对软骨诱导剂反应力下降; 3.骨碎补和淫羊藿水提液最佳促MSCs增殖浓度均为5μg/ml,最佳促MSCs骨向分化浓度分别为50μg/ml、500μg/ml。骨碎补和淫羊藿水提液诱导各组均能促进成骨指标的表达,且伴随TGF-β_1和BMP-2分泌增加; 4.低灌胃剂量益骨胶囊灌胃1 h后采血所得含药血清以25%的浓度干预时具有最佳的促MSCs增殖作用;最佳益骨胶囊含药血清促MSCs骨向分化浓度是高灌胃剂量灌胃1h后采血所得含药血清25%-30%添加浓度;益骨胶囊含药血清诱导各组均能促进成骨指标的表达,且伴随TGF-β_1和BMP-2分泌增加; 5.前期研究证实确有促MSCs骨向分化能力的中药单体淫羊藿苷和柚皮苷各诱导组均伴随TGF-β_1和BMP-2分泌增加; 6.rhTGF-β_1和rhBMP-2最佳促MSCs增殖浓度分别为10 ng/ml和80 ng/ml,最佳促MSCs骨向分化浓度分别为5 ng/ml和40 ng/ml,rhTGF-β_1和rhBMP-2诱导各组均能促进成骨指标的表达,且伴随TGF-β_1和BMP-2分泌增加; 7.rhTGF-β_1和rhBMP-2诱导各组均能提高Smad4和核心结合因α1(Core binding factor alpha1,Cbfα1)mRNA的表达量。 结论: 1.采用全骨髓贴壁法可获得稳定、均质性良好的大鼠MSCs; 2.OP大鼠MSCs骨向及软骨向分化能力下降,脂向分化能力增强: 3.中药骨碎补和淫羊藿水提液、益骨胶囊含药血清及细胞因子TGF-β_1、BMP-2均能促进MSCs骨向分化; 4.在MSCs骨向分化过程中,上调TGF-β_1、BMP-2的表达量可能是各干预药物促进MSCs骨向分化的作用机制之一; 5.各诱导药物可能通过增加TGF-β_1和BMP-2的分泌量,进而上调Smad4和Cbfα1mRNA的表达,来刺激MSCs骨向分化。……   
[关键词]:骨髓间充质干细胞;骨质疏松症;大鼠;中药;细胞因子;分化;成骨细胞
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:暨南大学2007年