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西瓜花叶病毒基因组全序列分析及其蚜虫体内受体蛋白的分离与鉴定

张建新

   西瓜花叶病毒(WMV)是马铃薯Y病毒属成员,由蚜虫以非持久性方式传播,广泛分布于世界各地,主要危害西瓜和甜瓜,引起花叶病。近几年该病害发生严重,已经成为制约西瓜和甜瓜高产稳产最主要的因素之一。本文完成了我国西瓜花叶病毒的基因组全序列的测定,在此基础上,克隆和体外表达了蚜传因子HC-Pro和CP蛋白,制备了相应抗体,利用Far western blot技术鉴定了其蚜虫体内的受体蛋白,并对三者互作关系进行研究,进一步阐明了非持久性传毒的分子机制。研究结果如下: 1.利用RT-PCR和5′-和3′-RACE技术,克隆了西瓜花叶病毒基因组编码区和非编码区,经序列拼接,得到了WMV RNA的全长cDNA,GenBank登录号为DQ399708,命名为中国株系(WMV-CHN)。分析发现,WMV具有单链正义RNA基因组,全长为10037个核苷酸,具有单一的开放阅读框(ORF),5′-末端和3′-末端各有一段非翻译区(UTR),3′-末端具poly(A)尾序。ORF长9651个核苷酸,起始于密码子AUG位于第133~135位核苷酸,终止密码子UAA位于第9784~9786位,编码一个由3217个氨基酸组成的分子量为365.8kD的多聚蛋白。 根据计算机分析,确定了WMV基因组的结构和相关保守基序。5′- UTR长132个核苷酸,富含A而少G(A占46.3%,G仅占6.1%),3′-UTR长254个核苷酸,富含T少C(T占近40%,而C仅占13%)。编码的多聚蛋白经自编码的蛋白酶裂解后可形成10个成熟蛋白,从N-端到C-端分别为P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP。 WMV-CHN与法国株系(WMV-Fr)基因组同源性比较发现,整个基因组除3’-UTR比法国株系多2个核苷酸,其他区域数目相等。整个基因组核苷酸同源性为92.5%,多聚肽为92.4%,不同成熟蛋白之间核苷酸和氨基酸同源性分别为87.5%-96.8%和90.1%-100%,NIa-VPg核苷酸差异最大。把WMV-CHN的CP和其他国家的WMV CP核苷酸和氨基酸进行比对和同源性分析,结果发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%。与其他Potyvirus属成员相比,同源性最高的是大豆花叶病毒(SMV),核苷酸和氨基酸同源性分别为78.4%和86.1%,其他依次是花生条纹病毒病毒(PStV)、菜豆普通花叶坏死病毒(BCMNV)、菜豆普通花叶病毒(BCMV)、黑眼豇豆花叶病毒(BCoMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),核苷酸和氨基酸同源性分别为68.3%和70.9%,67.2%和71.2%,67.3%和70.3%,67.7%和70.9%,62.2%和62.9%。 WMV的N末端与病毒进化密切相关,分析发现WMV-CHN的5’-UTR与近源的SMV、BCMV和PStV碱基数目相同,在N端有约50bp的保守区段。WMV P1蛋白N端的氨基酸与2个BCMV和3个PStV P1蛋白N端同源性较高,而C端与SMV同源性较高,WMV可能是BCMV或PStV与SMV种间重组的结果。 2.将WMV CP基因定向插入EcoRI/Sal I切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导2-8h后,成功表达了分子量约为37kD的CP蛋白。通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4h后蛋白开始表达,8h后表达量比较大。以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6400,Western blot分析能与CP发生血清学反应。 3.将WMV HC-Pro基因定向插入EcoRI/Sal I切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WHC,转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导2-8h后,成功表达了分子量约为57kD的HC-Pro蛋白。通过不同时间诱导发现,加入IPTG 2h后蛋白就开始表达,继续诱导到8h后表达量变化不大。以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV HC-Pro抗血清,ELISA法测其效价为1/6400,Western blot分析能与HC-Pro发生血清学反应。 4.将WMV HC-Pro基因定向插入EcoR I/Not I切开的pPIC9K中,构建了真核表达载体pPIC9K-WHC,经SalI单酶切后电转化Pichia pastoris GS115菌株,获得Mut+/His+表型高拷贝转化子。经1%甲醇诱导5d后,成功表达了分子量约为66kD的HC-Pro分泌蛋白。Western blot鉴定表明,表达蛋白可以和原核表达的HC-Pro蛋白的抗血清发生发生血清学反应,为筛选蚜虫体内传毒蛋白提供了基础。 5.通过Far western blot技术,用HC-Pro蛋白做诱饵,在WMV传播介体桃蚜体内全蛋白中筛选出6种不同分子量蛋白,大小分别约86kD、84kD、66kD、63kD、48kD、46kD,均能与WMV HC-Pro结合的蛋白,其中与66kD和63kD蛋白结合反应较强;而在非介体条沙叶蝉的全蛋白中只筛选出出1种66kD蛋白,结合反应很弱,条带比较模糊;用CP做诱饵蛋白,在介体桃蚜和非介体条沙叶蝉没有鉴定出蛋白。 6.用Far western blot研究了HC-Pro与CP之间的相互作用关系,结果发现,原核表达的CP蛋白能在NC膜上与HC-Pro特异结合,这不但验证了HC-Pro能与CP结合协助传毒的功能,说明体外原核表达的HC-Pro表现出与植物内分离的野生的蛋白有同样的生物功能。在研究受体蛋白、HC-Pro与CP三者互作时,受体蛋白结合HC-Pro后,不能再结合CP。 综上所述,本研究对WMV基因组学进行了分析,通过用HC-Pro与CP作为诱饵,筛选到与蚜虫传毒相关的多种蛋白,为非持久性传毒机制提供了实验证据。……   
[关键词]:西瓜花叶病毒;基因组全序列;受体蛋白;非持久性传播;原核表达;真核表达;far western blot
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2007年