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利用RNAi技术沉默玉米淀粉分支酶基因(sbeⅠ,sbe Ⅱb)表达的研究

郭新梅

   直链淀粉是重要的工业原料,可用于生产生物降解薄膜、胶卷、高级包装材料、工业酒精以及作为纺织加浆的原料。直链淀粉属于抗消化淀粉,食用后人体血糖水平不易升高,可用于制作糖尿病、肥胖、高血压、胆结石等病人的保健食品。 从普通玉米淀粉中提取直链淀粉的成本很高,只有高直链玉米淀粉才具有商业开发价值。高直链玉米淀粉在美国和欧洲已经商品化,我国还没有高直链玉米淀粉品种规模化商业种植。我国工业所需要的直链淀粉主要从美国进口,进口原料价格比普通玉米淀粉高10倍。 本研究利用RNAi技术,将含有玉米淀粉分支酶基因sbeⅠ、sheⅡb目标序列的反向重复序列的表达载体通过基因枪转化玉米愈伤组织,沉默玉米淀粉分支酶基因sbeⅠ、sheⅡb ,降低玉米支链淀粉合成,提高直链淀粉含量。研究了RNAi沉默玉米淀粉分支酶基因的技术路线、方法及遗传效应,探讨了RNAi技术在作物遗传改良中的应用前景,为高直链淀粉玉米品种或杂交种的培育奠定基础,主要结果如下: 1.本研究利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定了玉米淀粉分支酶基因sbeⅠ和sheⅡb的部分序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从玉米自交系综31中成功克隆到淀粉分支酶基因sbeⅠ和sheⅡb的部分序列。通过PCR方法从玉米自交系综31中成功克隆到淀粉分支酶基因sbeⅠ和sheⅡb的启动子序列,并从大肠杆菌中成功克隆了木糖异构酶基因xylA。构建了含有35S驱动的木糖异构酶基因和sbeⅠ启动子驱动的含有sbeⅠ目标序列的反向重复序列的表达载体pBAC418;构建了含有35S驱动的木糖异构酶基因和sbeⅡb启动子驱动的含有sbeⅡb目标序列的反向重复序列的表达载体pBAC413。 2.以19个玉米自交系为试验材料,研究了不同基因型和愈伤诱导培养基对玉米幼胚愈伤组织培养特性的影响。其中B73、黄C、478、综31、178、501等8个自交系具有较好的幼胚培养特性和植株再生特性,适宜作为受体材料进行遗传转化。此外,幼胚在附加4mg/L 2,4-D且去掉水解酪蛋白和L-脯氨酸的N6改良培养基上出愈率高、愈伤组织质地好,并大大减少了幼胚的自发性芽分化的趋势,有利于保持愈伤组织胚性、提高再生植株频率。 3.以178、478、黄C等玉米自交系的幼胚作为受体材料,将构建好的RNAi表达载体作成基因枪微弹轰击玉米愈伤组织。在含有不同筛选剂的诱导培养基上筛选后,转入分化培养基上继续筛选,分化的绿苗经过壮苗后移栽到大田。在利用木糖异构酶基因作为筛选标记基因的转化体系中,不同浓度的木糖筛选培养基上均可分化出玉米转基因再生植株,其中50%和100%木糖浓度的筛选培养基上玉米愈伤的筛选和再生情况较好。共得到68株转基因再生植株。但木糖筛选效率主要受玉米基因型的影响。通过xylA、FAD2 intron的DNA点杂交、PCR及PCR-Southern检测表明,外源筛选标记基因已经整合到植物基因组中。该木糖异构酶筛选体系摒弃了抗生素和除草剂,利用木糖异构酶的活性进行筛选,是一种安全的筛选标记,可以提高玉米遗传转化自交系改良的成功率和生物安全性。 4.对24株海南移栽成活的再生株系进行xylA和FAD2 intron的DNA点杂交、PCR、PCR-Southern检测。分子检测证明外源基因已整合到14株再生玉米植株的基因组中,其中5株为转化pBAC418的阳性再生玉米植株,9株为转化pBAC413的阳性再生玉米植株。 5.海南移栽成活的24株再生玉米植株经过自交、返祖雄结实等方式,共19株结实。经过检测的阳性再生植株有11株获得了结实种子。利用1255 Food﹠Feed Analyzer对转基因玉米株系的籽粒蛋白、油脂及总淀粉含量进行测定。阳性再生玉米株系的油脂含量高于受体对照,蛋白含量略低于受体对照的蛋白含量,总淀粉含量比受体对照的总淀粉含量稍低。采用农业标准数据库《水稻、玉米、谷子籽粒直链淀粉测定法》(GB7648-87),对其中9个株系的籽粒进行了直链淀粉含量分析。结果表明,转化pBAC418的再生玉米株系的直链淀粉提高幅度为3%~10.4%,转化pBAC413的再生玉米株系的直链淀粉提高幅度为0~15.6%。……   
[关键词]:玉米;淀粉分支酶;RNAi;直链淀粉;木糖异构酶
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2007年