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猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点区的表达及其优化

吕宁

   猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)引起的一种高接触性传染病。在TGEV编码的四种结构蛋白中,只有纤突蛋白(S蛋白)能够诱导中和抗体的产生。而位于S蛋白近N端A、B、C、D四个主要抗原位点片段诱导产生的免疫保护作用,几乎相当于整个S蛋白产生的诱导效应。因此,对于S蛋白抗原位点区的研究可以为TGE的诊断,预防提供一定的基础条件。 本研究以S基因抗原位点区作为目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,以IPTG诱导目的蛋白的表达。表达产物经SDS-PAGE电泳及Western-blot检测均与预期结果相符的基础上,利用自动诱导表达系统进一步提高目的蛋白的表达量。相关结果如下: 1.以带有全长S基因的质粒pGS为模板,通过PCR扩增2.1 kb的S基因抗原位点片段S1。并将其定向克隆至原核表达载体pET-28a中,构建了pET-S1原核表达重组质粒。 2.将带有重组质粒pET-S1的BL21(DE3)菌株,分别于37℃、30℃、28℃下诱导培养5 h后,收集菌液稀释105倍,涂布含Kanar和无抗性的LB平板,经菌落计数表明,在37℃和30℃诱导时,分别约有60 %和30 %的大肠杆菌细胞丢失重组质粒;而28℃诱导则pET-S1在大肠杆菌BL21(DE3)中可较稳定存在。SDS-PAGE电泳显示,37℃、30℃诱导条件下蛋白表达不明显,而将诱导温度降低至28℃时可明显提高目的蛋白的表达。 3.在28℃条件下以IPTG诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE电泳及Western-blot检测表明,目的蛋白产物大小与预期一致为76 ku,并且具有天然蛋白抗原性。通过凝胶分析软件Bandscan分析显示,随培养时间的增加,目的蛋白表达量逐渐增加,最高约占细菌总蛋白的25.9 %。未诱导的对照组也有少量目的蛋白的表达,约占菌体总蛋白的3.3 %。 4.分别设置pET-S1转化菌的诱导组和未诱导组,通过测定菌液振摇培养相同时间的OD600值表明,未诱导组在振摇培养初期菌液的OD600值可达到3.65,最高可达到6.19;而诱导组菌液的OD600值最高只可达到2.68,由此说明诱导开始后菌株的生长在一定程度上受到了限制。 5.利用自动诱导表达系统,通过重新定义菌株复苏生长以及目的蛋白诱导表达时的培养基组分,使目的蛋白表达量提高到45.1 %。 6.以IPTG诱导作为对照,pET-S1转化菌在自动诱导培养基中振摇培养12 h。菌液的OD600值和pH值表明,在IPTG诱导体系中,菌液OD600最高仅达到2.63,并且随诱导时间增加,菌液有逐渐偏碱性的趋势;反之在自动诱导体系中,菌液的OD600值最高可达到12.65。而pH值在振摇培养过程中基本接近中性。……   
[关键词]:猪传染性胃肠炎病毒;S基因;抗原位点;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷;自动诱导表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2007年