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重组hIFN-α-2b-BCG菌苗对膀胱肿瘤免疫治疗的实验研究

范晓东

   膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤,近年来的小剂量BCG和干扰素-α联合灌注的方案在治疗膀胱浅表肿瘤、预防肿瘤复发方面显示出了较好的耐受性和较高的完全反应率,在鼠的膀胱癌模型试验中也显示,BCG和干扰素-α联合应用的疗效均优于二者单独应用。BCG与干扰素-α联合应用时,由于降低了BCG用量,从而减轻了其毒副作用又保持了其抗肿瘤活性,同时,降低了干扰素-α大剂量反复灌注产生的高昂费用。虽然到目前为止干扰素-α提高BCG抗肿瘤作用的确切机制尚未清楚,但最近研究结果显示,干扰素-α可在以下几方面提高BCG的免疫活性:①协同免疫细胞诱导IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α等细胞因子产生;②活化T细胞增殖;③提高对膀胱肿瘤的直接作用,如直接抑制生长等。 为了解决联合灌注中干扰素半衰期短、用量大的缺点,自身能分泌细胞因子的重组BCG成为了新的研究热点。随着基因重组与分子克隆技术发展与进步,一种能够在Escherichia-coli和BCG共同复制外源基因的载体,以及载体上HSP(heat-shock protein,热休克蛋白)启动子和SS(信号序列)的发现,开始使重组BCG能够有效的表达不同的细胞因子、标志蛋白和抗原,重组BCG进入了一个新的时代。重组BCG以野生型BCG作为工程菌,利用基因工程技术将外源基因导人野生型BCG中,依靠BCG在宿主内复制,表达多种外源抗原,以诱导对多种疾病的特异性体液和细胞免疫。这种基因工程BCG疫苗与分枝杆菌佐剂加病原体抗原配制的混合疫苗相比,重组BCG集佐剂和载体于一身,兼多种外源基因与活疫苗于一体,一次接种可获得强而持久的多种特异性免疫。 重组BCG的成功构建也引发了新的课题,就是其体外生物学行为、细胞因子表达的稳定性、菌苗体外的抗肿瘤细胞增殖作用及活化诱导效应细胞的抗肿瘤活性、体内对肿瘤的治疗作用及全身和局部的免疫效应等等问题,本课题的目的就是分别采用体内外实验,探讨重组hIFN-α-2b-BCG菌苗的抗肿瘤效果及其作用机制,主要研究内容和结果如下: 1、重组hIFN-α-2b-BCG对外周血淋巴细胞的免疫调节 (1)测定重组BCG上清液中hIFN-α-2b的含量,与外源性hIFN-α-2b比较,结果发现重组BCG上清液IFN-α-2b浓度相当于5000IU/ml。 (2)分离人外周血中的单个核细胞(Peripheral blood monocytes,PBMC),将其和0.01 OD终浓度的重组BCG、野生型BCG以及野生型BCG联合干扰素-α共同培养,用MTT法测定PBMC增殖,并用ELISA法检测培养液中TH1型细胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α分泌水平。比较重组BCG与野生型BCG对PBMC诱导活化的不同效果;与野生型BCG联合干扰素组对比,比较一次性外源性干扰素的加入和重组BCG持续表达IFN-α-2b的作用效果。结果表明,重组BCG自身持续分泌IFN-α-2b对PBMC活化效果明显,PBMC增殖在72小时达峰值,增殖比例为4.96倍,高于野生BCG的2.5倍和野生型BCG联合干扰素组的3.6倍。TH1型细胞因子测定结果也得到同样的结论,测定PBMC活化表达IFN-γ的量峰值达到2977pg/ml、IL-12为292pg/ml、TNF-α为7914pg/ml,高于野生型BCG测定结果,且重组BCG活化PBMC效果强而持久,明显优于一次性干扰素的加入效果。 (3)对重组BCG上清液IFN-α-2b与等量外源性干扰素诱导TH1型细胞因子的生成水平进行比较,实验结果显示,上清液IFN-α-2b与等量的外源性干扰素生物学活性相近。 2、重组hIFN-α-2b-BCG抗膀胱肿瘤细胞效应的体外研究 (1)不同浓度重组BCG活化PBMC生成rBAK(Recombinant bacillus Calmette-Guerin activated killer)细胞,与人膀胱肿瘤细胞EJ共同培养,采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测rBAK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果,结果显示,未经诱导的淋巴细胞杀伤活性明显低下(7.6%),不同浓度的野生型BCG活化的BAK(bacillus Calmette-Guerin activated killer)细胞杀伤活性为12.38~20.89%;野生BCG与干扰素联合组活化效应细胞杀伤活性为15.78~34.72%;重组BCG活化的rBAK细胞杀伤效果达到实验组最高,为20.31~51.22%,与野生型BCG组相比有统计学差异。 (2)重组BCG与膀胱肿瘤细胞(EJ、MB49)共同培养,光镜下可见肿瘤细胞变圆,增殖速度明显减缓,部分细胞脱壁,胞浆可见大量空泡和颗粒状物质,细胞周围有菌群包绕,;透射电镜下可见肿瘤细胞表面微绒毛脱落,染色质溶解,细胞质坏死,出现大量空泡,细胞表面有出泡现象;吖啶橙染色可见肿瘤细胞聚集成团状细胞球体,胞突消失,细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体出现;Hoechst33258染色后荧光显微镜下可见大量肿瘤细胞出现明亮的蓝色荧光,表明重组BCG成功诱导肿瘤细胞凋亡。 (3)重组BCG与EJ细胞共同培养后48小时DNA电泳出现DNA Ladder,表明EJ细胞出现凋亡。 (4) MTT法测定重组BCG对膀胱肿瘤细胞(EJ、MB49)的抑制效应,结果表明肿瘤细胞的生长随着共同培养时间的延长不同程度的被重组BCG所抑制,且抑制率高于野生型BCG。 (5)重组BCG诱导MB49细胞凋亡的流式测定,24小时检测,野生型BCG诱导凋亡率为10.81%,而重组BCG诱导凋亡率达19.71%;48小时检测,野生型BCG为20.94%,重组BCG为46.58%,二者比较有显著性差异(P<0.05)。 (6)流式细胞检测表明,重组BCG与小鼠膀胱肿瘤细胞共同培养后,上调MB49细胞MHC-Ⅰ抗原的表达,具有时间依赖性,且上调比例明显高于野生型BCG,表明重组BCG有效提高肿瘤细胞的免疫原性,诱导免疫攻击。 3、重组hIFN-α-2b-BCG对原位膀胱肿瘤小鼠模型治疗效应的研究 (1)成功构建了C57BL/6原位膀胱肿瘤小鼠模型,重组BCG灌注治疗组的小鼠平均膀胱重量显著低于PBS对照组,与野生型BCG治疗组、野生BCG+IFN治疗组相比虽无统计学差异,但重组BCG治疗组的小鼠生存率高于野生型BCG治疗组,提示重组BCG对膀胱肿瘤的预后有一定的关系。 (2)采用流式细胞仪对小鼠膀胱灌注治疗后的淋巴细胞亚群进行分析,并测定小鼠血清中mTNF-α和mIL-12的水平,了解小鼠全身免疫状况。结果显示重组BCG灌注治疗后小鼠外周血CD4~+T细胞的比例明显增高,而CD8~+T细胞的比例则无明显变化,CD4~+/CD8~+比例大幅提高,纠正了荷瘤小鼠治疗前普遍存在的比例失调;荷瘤小鼠的外周血中TH1型细胞因子mTNF-α和mIL-12水平灌注治疗后大幅提高,表明重组BCG灌注具有增强荷瘤小鼠细胞免疫的作用。 (3)肿瘤组织冰冻切片进行T细胞亚群的免疫组织化学分析,了解重组BCG灌注治疗后膀胱局部免疫反应。重组BCG组的瘤组织内CD3~+、CD4~+、CD8~+检测强阳性,说明有大量淋巴细胞浸润,局部免疫反应明显。 (4)免疫组化检测P53和Fas在小鼠膀胱肿瘤中的表达。荷瘤小鼠膀胱肿瘤表达Fas为弱阳性,而重组BCG灌注后Fas呈明显的阳性表达,表明重组BCG可以显著提高Fas在膀胱肿瘤细胞的表达,增强了肿瘤细胞的免疫原性;荷瘤小鼠膀胱肿瘤P53表达强阳性,肿瘤浸润迅速,恶性度高,重组BCG灌注治疗后,P53表达显著下降,提示重组BCG与防止肿瘤恶性度增高有一定的关系。 通过以上研究,我们认为,重组hIFN-α-2b-BCG具有调节人外周血淋巴细胞增殖、活化TH1型细胞因子表达的能力,诱导杀伤膀胱肿瘤细胞;自身可抑制肿瘤细胞生长,诱导凋亡,上调肿瘤细胞MHC-Ⅰ抗原的表达;在小鼠体内具有调节系统及局部免疫能力的作用,纠正荷瘤小鼠淋巴细胞亚群的比例失调,增强局部淋巴细胞浸润,抑制肿瘤生长,上调荷瘤小鼠Fas的表达,诱导对肿瘤细胞的免疫攻击,下调P53的表达,影响肿瘤预后。……   
[关键词]:卡介苗;重组BCG;IFN-α-2b;膀胱肿瘤;免疫治疗;细胞因子;原位膀胱肿瘤模型;凋亡
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:天津医科大学2007年