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青蒿琥酯和维甲酸(X)对猪附红细胞体的药效检测及实时荧光定量PCR检测方法建立

李政萍

   附红细胞体病是由附红细胞体(Eperythrozoon)寄生于人和动物红细胞表面、血浆及骨髓中引起的一种人兽共患病。猪附红细胞体病主要引起仔猪发热、贫血、黄疸和母猪流产等,该病常与其他猪病混合感染,防治困难,危害十分严重,给养猪业造成巨大经济损失。但目前临床上对该病的治疗还没有特效药物,并且主要以镜检作为诊断该病的手段,包括鲜血压片和涂片染色,但是镜检容易出现假阳性。血清学诊断方法包括间接血凝试验(IHA)、补体结合试验(CFT)、对流免疫电泳(CIE)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光(IFA)等,但附红细胞体抗体水平的变化没有规律,常出现假阴性结果。动物实验是确诊的手段之一,但用时较长,在临床上应用不方便。常规聚合酶链式反应(PCR)又存在只能定性不能定量分析的弊端。为了筛选一种高效而又副作用较小的药物,本课题开展了猪附红细胞体体外药敏实验以及治疗试验。同时为了建立特异准确又能定量的诊断方法以检测给药后附红细胞体感染率的变化,本课题开展了附红细胞体病Real-time聚合酶链式反应诊断方法的研究。 用注射用青蒿琥酯及维甲酸(X)等药物进行附红细胞体体外药敏实验,并对自然感染附红细胞体的小型香猪以及人工感染附红细胞体的小鼠和大鼠进行药物治疗,镜检观察感染率的变化。体外药敏试验的结果表明,中浓度青蒿琥酯(200μg/mL)给药后24h,红细胞的附红细胞体感染率即从98.7%降至8.3%,到30h时镜检已基本没有附红细胞体感染的红细胞;而高浓度维甲酸(X)(1000μg/mL)在给药后6h,附红细胞体感染率已从98.7%降至0.3%,在9h,20h,24h和30h观察,其感染率均为0,贝尼尔以及盐酸咪唑苯脲效果不明显;青蒿琥酯(100μg/mL)与维甲酸(X)(500μg/mL)联合用药,在6h时其感染率即为0。治疗试验中维甲酸(X)疗效非常明显,青蒿琥酯需调整到合适的剂量才能发挥药效,药物浓度高反而没有治疗效果。 根据已报道的猪附红细胞体基因序列(GenBank序列号:AJ504999)设计了一对引物,扩增片段大小为234bp,将扩增产物测序,结果正确。特异性试验表明只有猪附红细胞体模板可以扩增出特异性条带,大肠杆菌、链球菌样品没有该条带,建立了特异性的Real-time PCR,其标准曲线斜率为-0.3013,相关系数为0.999,经β-actin归一化,用于检测附红细胞体感染率变化,准确特异,适合于附红细胞体的检测。……   
[关键词]:猪附红细胞体;荧光定量PCR;青蒿琥酯;维甲酸(X);人工感染
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2007年