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乙型脑炎病毒prM-E基因的克隆、表达及prM-E基因、E基因DNA免疫的研究

程龙

   乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是引起母猪繁殖障碍的主要病因之一,给养猪业造成了巨大的经济损失,同时乙型脑炎是一种人畜共患病,是人类中枢系统最常见的虫媒病之一。因此,建立一种安全、简便、经济的制备乙脑诊断抗原的方法,寻求稳定、安全、新型的乙脑基因工程疫苗已经成为当今JEV防治的主要研究方向。 本研究以乙型脑炎(JEV)SA14-14-2株全基因作为模板,根据文献设计出两对特异性引物,采用RT-PCR技术人工扩增出了JEV SA14-14-2株prM-E、E基因的cDNA。将纯化的prM-E基因成功地克隆到pUC19载体中,再转化到大肠杆菌JM109感受态细胞,得到的转化子经分子量比较和酶切分析筛选阳性克隆。结果表明,得到的阳性重组子(pUC19-prME)中含有prM-E基因,并且正确插入到载体中。将prM-E基因克隆到PET32a(+)载体上,得到的转化子经酶切分析,筛选出符合阅读框的重组子,构建成重组表达质粒PET-prME,再将重组表达质粒转化进宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达出约为89KDa、53KDa和36KDa的三条蛋白带。经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测证实表达产物具有免疫学活性,这为制备乙脑特异性抗原奠定了基础。 作者将prM-E、E基因克隆到pcDNA3.1(+)载体上,得到的转化子经酶切分析,筛选出符合阅读框的重组子,构建成重组质粒pcDNA-prME和pcDNA-E。将构建好的重组质粒对Balb/c鼠进行DNA免疫:每组5只、4周龄、雌性Balb/c鼠共4组,分别将溶于50μL灭菌PBS溶液的不同免疫原肌注于不同组鼠的左后肢,具体包括pcDNA-prME,pcDNA-E,pcDNA 3.1各50μg,单纯PBS 50μL,共免疫2次,间隔2周。二次免疫两周后,各试验组小鼠(5/5)健康存活。分别采集各组小鼠的血,并分离血清,利用中和试验对抗体进行效价测定。结果是pcDNA-PRME、pcDNA-E免疫组的中和滴度分别为1:35和1:20。可以得出结论:使用pcDNA-prME与pcDNA-E重组质粒对小鼠进行肌肉注射可以产生中和抗体,pcDNA-prME所致的中和滴度略高于pcDNA-E。目前针对黄病毒的疫苗大多包含包膜E蛋白的中和抗原表位,而prM蛋白对维持E蛋白结构是必要的。因此,本研究分别用pcDNA-prME、pcDNA-E免疫小鼠,对比其免疫效果,为JEV核酸疫苗的研发提供了一些资料,创造了一定的条件。……   
[关键词]:乙型脑炎病毒;prM-E基因;E基因;原核表达;DNA免疫
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2007年