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土壤中苏云金杆菌HBF-1菌株毒蛋白ELISA检测方法的建立及应用

吴瑞华

   本文以在我国分离获得的对丽金龟科幼虫高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis简称Bt)HBF-1为供试菌株,以其产生的杀虫晶体蛋白为检测目标,通过制备的抗Bt蛋白多克隆抗体,建立了土壤中HBF-1菌株毒蛋白含量的酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定方法。 抗原是影响抗体特异性和效价的重要因素。为了得到高纯度的杀虫晶体蛋白,本研究采用等电点法沉淀出晶体杀虫蛋白,用聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化粗提的杀虫晶体蛋白,得到分子量约为130kDa的电泳纯杀虫晶体蛋白,作为免疫用抗原。利用该抗原分四次对新西兰白兔进行免疫,获得了高特异性的抗血清,再用辛酸—硫酸铵盐析法,获得了高免血清中的免疫球蛋白IgG,SDS-PAGE电泳结果表明,提取的IgG纯度较高,其浓度达到5.6344mg/mL。采用改良的过碘酸钠法,用辣根过氧化物酶标记IgG,制备出标记率为0.28,克分子比为0.798的酶标抗体。 通过利用直接法、间接法和双抗夹心法等ELISA方法检测土壤中Bt毒蛋白的含量,综合样品检测值的相关系数CV,EC_(50)及检测率三个方面,明确双抗体夹心ELISA法均优于其它两种方法,间接ELISA法次之,从而证明双抗夹心法是一种检测土壤中Bt毒蛋白含量较适宜的方法。明确了双抗体夹心ELISA法的最佳工作条件:抗体的包被量为7μg/mL;Bt杀虫晶体蛋白的3种提取液(Tris—硼酸、Na_2CO_3缓冲液、PBST)中,以Na_2CO_3缓冲液为最佳提取液;封闭液为0.1%明胶-PBST;酶标抗体的最适工作浓度为1:800稀释;待测样品的反应时间为37℃120min;酶标抗体的时间为37℃60min;底物显色时间为室温15min。通过对该ELISA法的特异性试验、交叉性试验和重复性试验验证,证明双抗体夹心ELISA法是一种特异、敏感、快速、操作简便的方法。 利用优化的双抗夹心ELISA系统检测花生田里Bt蛋白的消长动态,结果表明利用双抗夹心ELISA法定量测定土壤中Bt蛋白的量能够明确反映出土壤中Bt毒蛋白含量的动态变化情况。在播种期施入Bt毒蛋白,原液及2倍稀释液土深20cm的处理在3d时达到最大含量,随后为平缓下降的趋势;原液和2倍稀释液土深2cm的处理在3d时蛋白含量上升,随后下降,在21d时检测量达到最高峰,随后下降至134d检测结束,在此过程中3~14d深土层20cm的蛋白含量明显高于浅土层2cm,随后除2倍稀释液21d、31d时有所例外,其余各处理均为深土层蛋白量高于浅土层。在开花前期施入Bt毒蛋白,四处理的蛋白含量3d达到最高,随后原液和2倍稀释液土深20cm的处理急剧下降,原液和2倍稀释液土深2cm的处理下降平缓。在开花后期施入Bt毒蛋白,四处理蛋白含量3~7d达到最高,随后呈平缓下降的趋势。因此,在不同施药时期,各处理深土层20cm的Bt蛋白量高于浅土层2cm。总之,在花生开花前期和开花后期进行灌根施药,土壤中Bt蛋白表达高峰期即为铜绿丽金龟(Anomala corpulenta Motschulsky)卵高峰期和幼虫一龄期、二龄初期,能够对金龟子幼虫达到最佳防治效果。……   
[关键词]:苏云金芽胞杆菌;杀虫蛋白;抗体;酶联免疫吸附分析;土壤
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2007年