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白血病免疫分型细胞芯片的研制

陈婕

   目的 白血病是导致恶性肿瘤死亡的主要疾病之一,其中急性白血病占35岁以下成人肿瘤死亡首位。在发病率最高的西欧、北美地区白种人中白血病年死亡率为3.2~7.4/10万人口;发病率低的亚洲、南美洲地区年死亡率为2.8~4.5/10万人口。我国年发病率与死亡率为2~4/10万人口,与欧美等国的类型分布有较明显的差别。在白血病的诊疗中,对白血病进行分型成为关键,不同类型的白血病其诊疗方案不同,疗效及预后也不同。80年代以前白血病的分型主要参照FAB分型标准。随着CD抗原不断被国际协作组确认,MICM分型已成为当今白血病诊断分型、预后判断和残留病变检测的标准。目前临床上进行白血病的免疫分型主要是应用流式细胞术及免疫组化技术,其分型受到标本量、价格、程序等的限制,而且一次实验只能分析1~4个表面抗原,漏掉了大量监测机体免疫状态的表面抗原指标。随着生物芯片技术的发展,学者们开始应用这种高通量、并行性、集成化的技术平台进行白血病的免疫分型研究。本实验是在前人的基础上对应用于急性白血病免疫分型诊断的细胞芯片进行深入研究,摸索其最佳点样条件、最佳孵育条件及稳定性,并用完善后的细胞芯片对白血病患者外周血标本进行免疫学分型,旨在为临床诊断和抗体靶向治疗提供快速、简便、完整的免疫学资料。 材料与方法 1、材料 (1)实验标本:医大一院化验室白血病患者外周血(幼稚细胞数>30%)及健康志愿者外周血。 (2)试剂及主要仪器:CD抗体,荧光标记一抗、二抗,免疫组织化学试剂盒等。主要仪器:生物芯片点样仪、激光共聚焦扫描仪、低温离心机、CCD图像分析系统。 2、方法 (1)最佳点样条件的确定 摸索不同浓度的单克隆CD抗体,制成细胞芯片以确定最佳点样条件。 (2)最佳孵育条件的确定 ①最佳标本细胞浓度的确定:摸索不同细胞浓度对细胞芯片的影响,以确定最佳。 ②最佳孵育时间的确定:摸索不同孵育时间对细胞芯片的影响,以确定最佳。 ③最佳孵育温度的确定:摸索不同孵育温度对细胞芯片的影响,以确定最佳。 3、稳定性试验 加速实验和周期为12个月的长期实验。 4、临床标本的免疫学分型 对72例临床白血病标本进行免疫学分型并验证结果。 结果 1、最佳点样条件 在单克隆CD抗体稀释浓度为50μg/mL时,信号达到饱和,信噪比最高;25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL点阵信号强度逐渐减弱,信噪比逐渐减低。 2、最佳孵育条件 在室温条件下(20℃),标本细胞悬液(5×10~6/mL)与细胞芯片孵育45min,点阵捕获细胞信噪比最高,点阵结合细胞特异性最好。 3、稳定性 三批芯片(050630、050718、050801)稳定性实验结果: (1)三批芯片在温度为(25.0±0.5)℃,相对湿度60%±5%的条件下贮存6个月,各时间点细胞芯片表观性质无变化,捕获细胞能力良好。 (2)三批芯片在-20℃冰箱中贮存12个月,各时间点细胞芯片表观性质无变化,捕获细胞能力良好。 (3)三批芯片在温度为(4.0±0.5)℃,相对湿度75%±5%的条件下贮存12个月,各时间点细胞芯片表观性质无变化,捕获细胞能力良好。 4、临床标本的免疫学分型 72例临床标本的免疫学分型结果:14例B-ALL:14例表达CD19和HLA-DR,5例表达CD20,5例表达CD22,8例表达CD79b,9例表达CD10,1例表达CD34;12例T-ALL:8例表达CD2,12例表达CD7,10例表达TCRαβ或TCRγδ,HLA-DR均不表达;46例AML(ANLL):46例均表达CD33,30例表达CD13,22例表达CD15,14例表达CD11b和CD14,1例表达CD235a,1例表达CD4而不表达CD2,23例表达HLA-DR。 结论 本实验采用浓度为50μg/mL的单克隆CD抗体制备的细胞芯片,于室温条件下(20℃)与标本细胞悬液(5×10~6/mL)孵育45min效果最好。此细胞芯片采用耐热加速实验法6个月稳定;耐低温加速实验法12个月稳定;长期实验法12个月稳定。实验说明细胞芯片在稳定性方面符合国际化规范。本实验所得的免疫分型结果与文献报道的白血病免疫分型结果一致,可作为临床白血病免疫学分型及抗体靶向治疗的依据。本实验室研制的细胞芯片重复性和稳定性好,为临床白血病免疫分型提供了一种更快速简便、高通量、并行性、集成化的技术平台。……   
[关键词]:细胞芯片;免疫分型;信噪比;CD抗体微阵列
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国医科大学2007年