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PKS5和互作分子伴侣DnaJ在ABA信号系统中的功能分析

秦云霞

   PKS5 (SOS2-like Protein Kinase 5)属于PKS家族25个成员之一,PKS5编码435个氨基酸。PKS5通过磷酸化和抑制细胞质膜上H+-ATPase的活性,在保护植物免受碱性环境的胁迫中具有重要的作用。同时PKS5的表达受到ABA、盐、甘露醇、葡萄糖、干旱和其它渗透胁迫等的上调表达,意味着它可能参与拟南芥中多种生物学应答过程。为了研究它的功能,我们从拟南芥研究中心订购了七个pks5突变体,包括一个T-DNA插入突变体和6个Tilling(Targeted Induced Local Lesion)点突变体。纯合突变体经过不同的非生物胁迫和激素处理,发现其中两个点突变体pks5-6和pks5-7只在萌发阶段对脱落酸ABA超敏感,而T-DNA突变体和其它位点突变的突变体与野生型没有差异。在突变体pks5-6中基因发生了c-t的突变,造成317位丝氨酸变为亮氨酸(S317L),在突变体pks5-7中发生的c-t转换使蛋白的第168位丙氨酸变为缬氨酸(A168V)。PKS5-7突变位于已知的激酶激活环内,而PKS5-6突变位于FISL基序内。这两个突变位点所在的结构域在PKS家族中都很保守。 为了探讨造成突变体pks5-6和pks5-7ABA表型可能的原因,PKS5和各个位点突变的蛋白被表达出来,进行体外磷酸化分析。结果表明只有PKS5-6和PKS5-7蛋白的激酶活性升高了,是PKS5本身的5~8倍。 为了阐明PKS5在ABA信号转导系统中的可能作用机制,我们以PKS5为诱饵(Bait),用酵母双杂体系筛选一cDNA表达文库,并得到23个互作蛋白。 为了检验这23个蛋白是否是PKS5激酶的底物,在体外表达这些蛋白并做了磷酸化分析,实验结果证明其中两个蛋白PIP133和PIP55能被PKS5磷酸化。 PIP145(编码一个DnaJ-Like伴侣蛋白)与PKS5互作很强。我们进一步用酵母双杂交实验又确认了PKS5和DnaJ互作的区域。PKS5的C末端的调控区域与DnaJ的C末端存在很强的互作。PKS5蛋白C端的FISL motif和PPI结构域对它们之间的互作很重要。 免疫共沉淀(Co-IP)分析证明PKS5和DnaJ在植物细胞内是互作的。体外的蛋白磷酸化分析表明,DnaJ抑制PKS5的激酶活性,而且随着DnaJ蛋白量的增加,激酶活性降低越多。 遗传学上,DnaJ的两个T-DNA插入纯合突变体dnaj13和dnaj14的表型与pks5-6和pks5-7点突变一样,只在萌发阶段对ABA的抑制作用表现得更敏感。 实时相对定量PCR分析表明,PKS5和DnaJ在45天的野生型Col0植株中是组成型表达。而GUS表达分析表明这两个基因在幼根中表达量很高,这为它们在萌发期的互作提供了基础。 另外更重要的是,双突变体在外源ABA处理下的萌发表型与我们的体外生化实验结果是一致的,可以解释PKS5参与的ABA信号调控的机制。双突变体dnaj13 pks5与野生型没有差异;而双突变体dnaj13 pks5-7和dnaj13 pks5-6比亲本pks5-6,pks5-7和dnaj13都更敏感,而且都只在种子萌发期。即PKS5的激酶活性强弱对植物应答ABA胁迫具有重要作用,同时说明了DnaJ在ABA信号传导过程中的功能是依赖于PKS5。 因为在Tilling突变体pks5-6和pks5-7中,PKS5-6,PKS5-7的激酶活性比野生型蛋白增强很多,表现出ABA敏感的表型。pks5敲除突变体没有ABA表型;在野生型Col0中,DnaJ抑制PKS5的激酶活性,所以没有ABA的表型。当DnaJ功能由于T-DNA插入而失去时,PKS5的激酶活性增强,因而也表现出与点突变相似的表型,即ABA敏感。在dnaj13 pks5-7和dnaj13 pks5-6双突变体中没有DnaJ的抑制作用,PKS5-6,PKS5-7的激酶活性可能要增加更多,反映在突变体就是对ABA超敏感。而在dnaj13 pks5双突变体中,PKS5功能蛋白不存在,所以对ABA的胁迫没有反应。 因此我们用遗传学材料和生化数据证明PKS5参与ABA信号系统的调控;与PKS5互作的分子伴侣DnaJ通过抑制PKS5的激酶活性协同参与ABA在种子萌发期的信号调控。本实验揭示了PKS5的功能,也是植物中第一次报道分子伴侣参与信号调控的例子。……   
[关键词]:蛋白激酶;钙结合蛋白;脱落酸;J-蛋白;分子伴侣
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华南热带农业大学2007年